Contenido
Introducción
1. Fosfolipasas
1.1 Clasificación. Propiedades
1.2Sistema fosfolipasa C - inositol-3-fosfato
2. Fosfolipasa A2
2.1 Información general (reacción, descubrimiento, estructura)
2.2 Clasificación y propiedades
2.2.1 PLA2 citosólica
2.2.2 PLA2 secretora
2.2.3 PLA2 independiente del calcio
2.3 Especificidad del sustrato
2.4 inhibidores de PLA2
2.4.1 Inhibición no competitiva
2.4.2 Inhibición competitiva


2.7 Papel biológico del PLA2
Bibliografía

Introducción
Las fosfolipasas (ing. fosfolipasa) son enzimas de la clase de hidrolasas que catalizan la hidrólisis de los fosfoglicéridos... Dependiendo de la posición del enlace hidrolizado en el fosfolípido, existen 4 clases principales de fosfolipasas: A, B, C y D.
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Los lisofosfolípidos son escindidos por fosfolipasas L (no se ha demostrado la existencia de fosfolipasas L1 y L2 específicas de posición). Fosfolipasa B es un nombre obsoleto. Fármacos con actividad tipo fosfolipasa A y L.
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X - residuo de colina, serina, mioinositol, etc.; para fosfolipasas L1R2=C(O)R4, R3=H; para fosfolipasas L2 R2=H, R3=C(O)R4
Cada una de las familias de fosfolipasas es heterogénea e incluye enzimas que difieren significativamente en pesos moleculares, composición de subunidades y otras propiedades. Todas las fosfolipasas catalizan más activamente la hidrólisis en la interfaz fosfolípido-agua; Hidrolizar lentamente sustratos solubles en agua.
Fosfolipasa A1 - (EC 3.1.1.32, fosfolipasa A1 en inglés) escinde la cadena acilo SN-1.
Fosfolipasa A2 - (EC 3.1.1.4, fosfolipasa A2 en inglés) escinde la cadena acilo SN-2.
La fosfolipasa B- (lisofolipasa, fosfolipasa B inglesa) escinde las cadenas de acilo SN-1 y SN-2. Fosfolipasa, que tiene las actividades tanto de la fosfolipasa A1 como de A2, es decir, capaz de hidrolizar la cadena acilo de un fosfolípido en las posiciones sn-1 y sn-2.
Fosfolipasa C - (EC 3.1.4.3, fosfolipasa C en inglés) hidroliza el enlace entre el resto glicerol del fosfolípido y el grupo fosfato polar, lo que da como resultado la formación de diacilglicerol y un grupo polar que contiene fosfato.
Fosfolipasa D - (EC 3.1.4.4, fosfolipasa D en inglés) hidroliza el enlace entre el grupo fosfato y el grupo alcohol, liberando ácido fosfatídico y alcohol. Hay 2 isoformas de esta fosfolipasa D1 y D2.
Las fosfolipasas juegan un papel importante en el metabolismo de los lípidos en los organismos vivos. Se utilizan para determinar la estructura de los fosfoglicéridos y su ubicación en las membranas.

1. Fosfolipasas.
1.1 Clasificación. Propiedades
De hecho, se distinguen varias fosfolipasas del grupo A; son parte integral de muchos tejidos y secreciones de organismos vivos.
Las fosfolipasas A1 son en su mayoría enzimas intracelulares, a menudo unidas a membranas, y no requieren una coenzima. Sus pesos moleculares varían entre 15.000 y 90.000; la actividad catalítica óptima se produce a un pH de 4,0 (para enzimas lisosomales) o de 8,0 a 9,5 (para enzimas de microsomas, membranas plasmáticas y citosol); Ampliamente distribuido en tejidos animales (hígado, corazón, cerebro) y microorganismos (Bacillus subtilis, B. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli).
Las fosfolipasas A1 escinden la cadena acilo del fosfolípido en la posición sn-1. La acción de la fosfolipasa A1 sobre un fosfolípido produce 1-lisofosfolípido y un ácido graso. La fosfolipasa es un componente activo del veneno de serpiente con acción hemolítica.
Las fosfolipasas A2 son los representantes más estudiados de las fosfolipasas. Se conocen 3 grupos de fosfolipasas A2: 1) enzimas de los venenos de serpientes, reptiles e insectos, que existen en forma de una gran cantidad de isoformas; 2) enzimas del páncreas de los mamíferos, producidas en el organismo en forma de zimógenos (precursores de mayor peso molecular) y activadas por tripsina; 3) enzimas intracelulares de la sangre y los tejidos de los animales, entre las que se encuentran tanto las solubles como las unidas a membranas.
Las fosfolipasas A2 de los dos primeros subgrupos son enzimas solubles en agua con un peso molecular de 11 a 19 mil (algunas son activas en forma de dímeros), tienen una alta estabilidad debido a una gran cantidad (6-7) enlaces disulfuro. Actividad catalítica óptima a pH 7,5-9,0; pI de 4,0 a 10,5; coenzima - Ca2+. Para muchos representantes de estos subgrupos de fosfolipasas, se conocen las estructuras primaria y espacial. En el centro activo se encontraron residuos de histidina y ácido aspártico. Las propiedades de las fosfolipasas A2 intracelulares (tercer subgrupo) dependen de la localización subcelular de la enzima. Su peso molecular es de 12 a 75 mil; Actividad catalítica óptima a pH 4,2-9,0. Algunas enzimas de este subgrupo no contienen coenzimas.
Las fosfolipasas B se aíslan de plantas, microorganismos, veneno de abejas y tejidos de mamíferos. Las enzimas de este grupo son extremadamente inespecíficas, catalizan la hidrólisis de varios enlaces éster y tienen un efecto lítico (destructivo) en relación con las membranas biológicas (lo que determina su toxicidad). El peso molecular de las fosfolipasas B es de 15 a 65 mil, son menos estables que las fosfolipasas A; su actividad catalítica óptima se produce a un pH de 4,5 (enzima lisosomal) a 10,0 (enzimas venenosas). Las fosfolipasas no tienen coenzimas y no son inhibidas por el ácido etilendiaminotetraacético. Algunas fosfolipasas B son inhibidas por el fluorofosfato de diisopropilo y el ácido p-cloromercurbenzoico. Inhibidores universales de todas las fosfolipasas B - tensioactivos.
La fosfolipasa B es capaz de hidrolizar la cadena acilo de un fosfolípido en las posiciones sn-1 y sn-2. Como regla general, la fosfolipasa actúa sobre la lisolecitina (lisofosfatidilcolina), que se forma como resultado de la acción de la fosfolipasa A1 nalecitina (fosfatidilcolina). ).
Fosfolipasas Se encuentran en las bacterias Clostridium, Bacillus y Pseudomonas, así como en células de mamíferos (hígado, cerebro, páncreas). Algunos de ellos se caracterizan por una especificidad estricta con respecto al grupo alcohol de la molécula sustrato, por ejemplo, el residuo de colina (fosfolipasa Cx) y mioinositol (fosfolipasa C). El peso molecular de las fosfolipasas C es de 23 a 51 mil Zn2+. Los iones son una coenzima y un estabilizador para ellos. Actividad catalítica óptima a un pH de aproximadamente 7 para las fosfolipasas Cx y a un pH
La fosfolipasa C, que hidroliza el enlace fosfodiéster entre el residuo de glicerol del fosfolípido y el grupo fosfato polar, pertenece tanto a las fosfodiesterasas como a la fosfolipasa D. La fosfolipasa C es una enzima clave en el metabolismo del fosfatidilinositol y las vías de señalización de los lípidos.
La fosfolipasa C es activada por las subunidades Gαq o Gβγ de la proteína G. Por tanto, es parte de un receptor acoplado a proteína G y su correspondiente vía de señalización o parte de un receptor transmembrana con actividad tirosina quinasa intrínseca o asociada.
La fosfolipasa C hidroliza el fosfatidilinositol (PIP2) en los dos mediadores secundarios trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG). Estos mediadores participan en etapas posteriores de las vías de señalización. En particular, modulan los canales de calcio del retículo endoplásmico y la proteína quinasa C, respectivamente.
La fosfolipasa D pertenece a un grupo de enzimas importantes que realizan una variedad de funciones en los sistemas vivos, desde la absorción de nutrientes hasta la síntesis de compuestos biológicamente activos. Se encuentra en plantas (vegetales, algas), microorganismos y tejidos animales. Su peso molecular es de 90 a 116 mil. Actividad catalítica óptima a pH 4,7 a 8,0. Los tensioactivos catiónicos inhiben las fosfolipasas D, mientras que los tensioactivos aniónicos las activan.
La fosfolipasa D exhibe principalmente actividad hidrolítica, lo que resulta en la escisión del enlace éster entre el ácido fosfatídico y los residuos de alcohol en las moléculas de fosfolípidos (PL). En este caso, este último se reemplaza por hidrógeno, pero el residuo de ácido fosfatídico se puede transferir a una variedad de aceptores que contienen hidroxilo, lo cual es de gran interés para la biotecnología, ya que la actividad de transfosfatidilación de la fosfolipasa se puede aprovechar para la síntesis de varios drogas.
La fosfolipasa D escinde específicamente la fosfatidilcolina en ácido fosfatídico y colina, liberando este último en el citoplasma.
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fosfatidilcolina ácido fosfatídico colina
1.2 Fosfolipasa C - sistema inositol-3-fosfato
La activación de la guanilato ciclasa de membrana no se produce bajo la influencia directa del complejo hormona-receptor, sino indirectamente a través de calcio ionizado y sistemas de membrana oxidantes. La estimulación de la actividad de la guanilato ciclasa, que determina los efectos de la acetilcolina, también se produce indirectamente a través del Ca2+. Mediante la activación de la guanilato ciclasa, se realiza el efecto de la hormona inatriurética auricular, el atriopéptido. Al activar la oxidación del peróxido, la hormona endotelial de la pared vascular, el óxido nítrico, un factor endotelial relajante, estimula la guanilato ciclasa. Bajo la influencia de la guanilato ciclasa, el GMPc se sintetiza a partir de GTP, que activa las proteínas quinasas dependientes de GMPc, que reducen la tasa de fosforilación de las cadenas ligeras de miosina en los músculos lisos de las paredes vasculares, lo que lleva a su relajación.
En la mayoría de los tejidos, los efectos bioquímicos y fisiológicos del AMPc y del GMPc son opuestos. Los ejemplos incluyen la estimulación de las contracciones cardíacas bajo la influencia del AMPc y su inhibición por el GMPc, la estimulación de la contracción de los músculos lisos intestinales por el GMPc y la inhibición del AMPc. cGMP asegura la hiperpolarización de los receptores de la retina bajo la influencia de fotones de luz. La hidrólisis enzimática del cGMP y, en consecuencia, el cese del efecto hormonal, se lleva a cabo mediante una fosfodiesterasa específica.
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Mediación de señales hormonales por el sistema fosfolipasa C-inositol-3-fosfato.
La formación de un complejo hormona-receptor con la participación de una proteína G reguladora activa la fosfolipasa C de membrana, lo que provoca la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana con la formación de dos mensajeros secundarios: inositol-3-fosfato y diacilglicerol. El inositol-3-fosfato conduce a la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares. La unión del calcio ionizado a una proteína especializada, la calmodulina, activa las proteínas quinasas y provoca la fosforilación de enzimas y proteínas estructurales intracelulares. El diacilglicerol aumenta la afinidad de la proteína quinasa C por el Ca2+, promoviendo su activación, que también culmina en los procesos de fosforilación de proteínas. Al mismo tiempo, el diacilglicerol implementa otra forma de mediar el efecto hormonal, activando la fosfolipasa A2 y la formación de prostanoides.
El complejo receptor hormonal con la participación de la proteína G reguladora conduce a la activación de la enzima fosfolipasa C de membrana, que provoca la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana con la formación de dos segundos mensajeros: inositol-3-fosfato e idacilglicerol. El inositol-3-fosfato provoca la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, principalmente del retículo endoplásmico, el calcio ionizado se une a la proteína especializada calmodulina, lo que asegura la activación de las proteínas quinasas y la fosforilación de proteínas y enzimas estructurales intracelulares. A su vez, el diacilglicerol contribuye. ante un fuerte aumento de la afinidad de la proteína quinasa C por el calcio ionizado, activa este último sin la participación de la calmodulina, lo que también finaliza con los procesos de fosforilación de proteínas.
Al mismo tiempo, el diacilglicerol implementa otra forma de mediar el efecto hormonal mediante la activación de la fosfolipasa A2. Bajo la influencia de este último, se forma ácido araquidónico a partir de fosfolípidos de membrana, que es una fuente de sustancias con potentes efectos metabólicos y fisiológicos: prostaglandinas y leucotrienos. En diferentes células del cuerpo prevalece una u otra vía para la formación de mensajeros secundarios, lo que en última instancia determina el efecto fisiológico de la hormona. A través del sistema considerado de mensajeros secundarios, se realizan los efectos de la adrenalina (en combinación con el receptor alfa adrenérgico), la vasopresina (en relación con el receptor V-1), la angiotensina I, la somatostatina y la oxitocina.

2. Fosfolipasa A2
2.1 Información general (reacción, apertura, estructura)
La fosfolipasa A2 (E.F.3.1.1.4.) es una enzima que cataliza la escisión de residuos de ácidos grasos (lecitina, cefalina) de los fosfolípidos, convirtiéndolos en compuestos tóxicos que reducen en gran medida la tensión superficial. Estos compuestos disuelven los glóbulos rojos y otras estructuras celulares y subcelulares y por eso se denominan lisolecitinas y lisocefalinas.
En la molécula de fosfolípidos, la fosfolipasa del veneno de abeja separa el ácido graso del segundo lugar de la molécula y, por lo tanto, se llama fosfolipasa A2. Se conoce desde 1897 (Langer) como un factor que potencia la actividad hemolítica del veneno de abeja tras la adición de lecitina. La fosfolipasa es la enzima más estudiada del veneno de abeja. La fosfolipasa fue descubierta como enzima digestiva en 1900. Ahora está claro que la fosfolipasa A2 (PLA2) es más que una enzima digestiva. Está muy extendido y presente en la mayoría de las células y tejidos de los mamíferos, y actúa como regulador del metabolismo, manteniendo la homeostasis de la membrana y la formación de precursores de eicosanoides.
Dependiendo del peso molecular, la localización celular y la presencia de iones Ca2+, se distingue entre PLA2 citosólica, PLA2 secretora e independiente de Ca o PLA2 de membrana externa.
Las PLA2 comprenden varias familias de proteínas no relacionadas con actividad enzimática común. Las dos familias más importantes son las fosfolipasas A2 citosólicas secretadas.
PLA2 citosólica:
Las fosfolipasas intracelulares, así como las extracelulares, son enzimas dependientes del calcio. Estructuralmente, sin embargo, son fosfolipasas secretadas muy diferentes. Como regla general, son mucho más grandes (más de 700 aminoácidos) y contienen un dominio C2, que dirige la enzima a la membrana celular. Estas fosfolipasas participan principalmente en vías de señalización celular como la respuesta inflamatoria. Bajo la influencia de PLA2, se puede formar en la célula ácido araquidónico, un precursor de los eicosanoides, moléculas de señalización activas como los leucotrienos y las prostaglandinas.
Membrana exterior PLA2:
Las bacterias gramnegativas contienen PLA2 en su membrana externa con una amplia gama de especificidad. En Escherichia coli, esta enzima participa en la liberación de la toxina bacteriocina de la célula debido al aumento de la permeabilidad de la membrana con un aumento en el nivel de lisofosfolípidos y ácidos grasos en la membrana.
PLA2 secretada:
Se han aislado formas extracelulares de fosfolipasas de diversos venenos de serpientes, abejas y avispas. También se encuentran en todos los tejidos de mamíferos y bacterias. La actividad de estas fosfolipasas requiere la presencia de calcio.
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Fosfolipasa A2 del veneno de abeja en el espacio extracelular cerca de la bicapa lipídica. Los grupos polares de fosfolípidos se encuentran entre los planos amarillo y rojo. Las cadenas de acilo no polares se encuentran entre los planos rojo y negro.
La fosfolipasa pancreática es una enzima digestiva y participa en la digestión de los lípidos alimentarios. Las fosfolipasas del veneno intervienen en la inmovilización de la víctima debido a la lisis de sus células.
2.2 Clasificación y propiedades
2.2.1 PLA2 citosólica
La historia de las fosfolipasas citosólicas del grupo A2 comenzó en 1991, cuando del citosol de varias células animales se aisló y clonó una proteína con un peso molecular de 85 kDa, que, además de su peso molecular, se diferenciaba de las fosfolipasas conocidas en ese momento. tiempo en ausencia de puentes disulfuro y sensibilidad al calcio. Posteriormente, el examen de bases de nucleótidos permitió encontrar dos parálogos más: cPLA2b y cPLA2g. La primera proteína encontrada se denominó cPLA2a. Sin embargo, la enzima, llamada "citosólica", actúa sobre las membranas del retículo citoplasmático y del núcleo. Esta isoforma de PLA2 está presente en muchas células y tejidos: cerebro, riñones, bazo, pulmones, macrófagos, neutrófilos, células epiteliales alveolares, etc. La enzima se activa como resultado de la fosforilación por las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la proteína quinasa C. Diversas citoquinas extracelulares, mitógenos, hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, antígenos, endotoxinas, así como ciertas influencias físicas y de estrés, incluida la luz ultravioleta y el estrés oxidativo, inducen la activación y síntesis de PLA2 citosólica.
La característica principal de este isotipo de enzima es que hidroliza más activamente los sustratos fosfolípidos que contienen ácido araquidónico en la segunda posición. Esta selectividad de sustrato determina la función principal de la enzima en la célula.
La estructura espacial de esta enzima se caracterizó mediante resonancia magnética nuclear; Los datos estructurales radiológicos aparecieron algo más tarde. La enzima hidroliza el enlace éster en la posición sn-2. Para exhibir la máxima actividad enzimática, se requieren concentraciones relativamente bajas de iones Ca2+ (alrededor de 500 nmol/l); Además, la presencia de iones Ca2+ no es necesaria para la manifestación de la actividad enzimática, sino para la unión de la proteína a la superficie de las membranas intracelulares o, en el caso de sistemas modelo, a partículas lipídicas. La enzima prácticamente no distingue entre grupos en la posición sn-1, pero tiene especificidad por los fosfolípidos que contienen ácido araquidónico en la posición sn-2. Los ácidos oleico (18: 1) y linoleico (18: 2) se escinden débilmente de los fosfolípidos correspondientes mediante cPLA2a, pero los ácidos a-linoleico (18: 3) y eicosapentaenoico (20: 5) tienen ventajas sobre el ácido araquidónico. Dado que estos ácidos se encuentran en concentraciones extremadamente bajas en las células, los fosfolípidos con ácido araquidónico en la posición sn-2 se convierten en el sustrato principal. La enzima no muestra especificidad por el sustituyente en la posición sn-3, pero sin embargo el diacilglicerol no es su sustrato. Además de la actividad principal, la enzima también presenta actividad lisofosfolipasa, es decir, es capaz de escindir el acilo de la posición sn-1 de un lisofosfolípido. Se supone que esta actividad es necesaria para proteger a la célula de una mayor concentración de lisofosfolípidos. , que puede alterar las funciones de la membrana. Se ha demostrado que la enzima también puede exhibir actividad transacilasa. Se está estudiando la importancia biológica de esta actividad.
Los parálogos de PLA2 citosólica se han descrito recientemente y la información sobre sus propiedades es limitada. Se sabe que la proteína cPLA2g no contiene un dominio de unión a calcio y es independiente de los iones Ca2+; Tiene sólo un 29% de similitud con la secuencia de aminoácidos de la proteína cPLA2a. Está unido a la membrana a través de un sitio palmítico y exhibe principalmente actividad isofosfolipasa. Se ha demostrado su participación en el desarrollo de la apoptosis de macrófagos. La proteína cPLA2b tiene un dominio de unión a calcio, pero también presenta predominantemente las propiedades de PLA1, es decir. hidroliza el enlace sn-1.
La enzima cPLA2a es actualmente la única fosfolipasa específica del ácido araquidónico y prefiere sustratos localizados en la membrana a aquellos en forma monomérica en solución. Quizás estas propiedades puedan explicarse por la existencia de una “tapa” anfifílica (residuos de aminoácidos 413). -457), que impide la entrada del residuo de ácido graso del fosfolípido al túnel del centro activo si la proteína no está localizada en las membranas. La "tapa" se abre cuando la proteína interactúa con los lípidos de la membrana. La catálisis interfacial llevada a cabo por esta enzima ha sido intensamente estudiada.
Descubrimiento de la PLA2 citosólica a finales de los años 1980. impulsó el estudio de la regulación de la síntesis de eicosanoides en el cuerpo durante una respuesta aguda a diversos estímulos proinflamatorios. La regulación de la fosfolipasa secretora se produce a nivel de su expresión, y la actividad de la fosfolipasa citosólica en la célula también se regula a nivel de actividad enzimática. Los principales factores que influyen en la actividad de la fosfolipasa citosólica son la concentración de Ca2+ intracelular y la fosforilación de esta enzima por las proteínas quinasas. La concentración de iones Ca2+ y la actividad de varias proteínas quinasas en la célula son parámetros muy lábiles que cambian a los pocos segundos. la unión de ligandos - agonistas con los receptores celulares correspondientes, lo que permite regular eficazmente la producción en la célula de ácido araquidónico y, en consecuencia, la síntesis de eicosanoides.
En las células no activadas, la concentración de Ca2+ intracelular suele oscilar entre 30 y 100 nmol/l. Cuando se activan varios receptores, la concentración de iones Ca2+ puede alcanzar 1-3 µmol/l. Varios estudios han demostrado que se produce un aumento de la actividad de la PLA2 citosólica en el rango de concentración de iones Ca2+ de 150 a 800 nmol/l. Con un aumento en la concentración de iones Ca2+, la fosfolipasa migra a las membranas y se adhiere a ellas, después de lo cual comienza la hidrólisis de los fosfolípidos.
La unión de la fosfolipasa a la membrana se produce debido al dominio C2 presente en la proteína:
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El dominio C2 es homólogo a dominios similares de la proteína quinasa C, GTPasa y fosfolipasa C. Todas estas proteínas se unen a las membranas en presencia de iones Ca2+. La presencia de concentraciones suficientes de iones Ca2+ es necesaria para la orientación de la fosfolipasa y su unión. . En ausencia de iones Ca2+, la enzima permanece activa frente a sustratos solubles, como la 1-palmitil-2-lisofosfatidilcolina.
Dependiendo del tipo de agonista, la concentración de iones Ca2+ en la célula cambia de manera diferente. Algunos agonistas provocan su crecimiento intracelular de corta duración; Bajo la influencia de estos agonistas, la concentración de iones Ca2+, después de un fuerte aumento, vuelve al nivel inicial en 1-2 minutos. Otros provocan un aumento prolongado en la concentración de iones Ca2+, y la concentración aumentada de iones Ca2+ permanece en la célula durante 5 a 30 minutos. Se demostró en células epiteliales que para una unión estable de PLA2 a la superficie de las membranas biológicas, se requiere una mayor concentración de iones Ca2+ durante 5 minutos y, con un aumento a corto plazo después de 1-2 minutos, la disociación inversa de la proteína en el citosol se produce sin una liberación perceptible de ácido araquidónico. Si el aumento de la concentración de iones Ca2+ persiste durante 5 minutos o más, entonces la fosfolipasa citosólica PLA2 permanece en la membrana y la hidrólisis de los fosfolípidos continúa incluso después de que la concentración intracelular de Ca2+ vuelve a los valores normales.
Para la manifestación de la máxima actividad fosfolipasa con un aumento a corto plazo en la concentración de iones Ca2+ dentro de la célula, también es necesaria la fosforilación de la proteína por parte de las quinasas. Los experimentos in vitro han demostrado que la fosfolipasa citosólica puede ser fosforilada por la proteína quinasa C, las proteínas quinasas activadas por mitógenos p42/p44 o la proteína quinasa A, pero sólo la fosforilación por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) conduce a un aumento significativo de la actividad de la fosfolipasa. . Las proteínas quinasas activadas por mitógenos fosforilan la fosfolipasa en Ser-505. En algunos casos, es la fosforilación la que determina la manifestación de la actividad fosfolipasa en la célula.
Así, la fosfolipasa citosólica participa tanto en la regulación de la síntesis de eicosanoides durante una respuesta celular aguda a diversos estímulos proinflamatorios como, en algunos casos, durante una respuesta retardada. Los principales factores que regulan la actividad de la fosfolipasa citosólica son la concentración de Ca2+ intracelular y la actividad. de proteínas quinasas activadas por mitógenos. La actividad enzimática puede aumentar significativamente durante los primeros minutos después de la estimulación celular. La translocación de la enzima tras la activación es importante por dos razones: 1) permite que la enzima interactúe con los fosfolípidos de la membrana; 2) suministra lipasa selectiva del ácido araquidónico al lugar donde se encuentran las enzimas para la síntesis de prostaglandinas (PG) y leucotrienos (LT), es decir, es potencialmente posible la formación de un compartimento en el que el ácido araquidónico liberado se metaboliza directamente.
2.2.1 PLA2 secretora
Las PLA2 secretoras tienen un peso molecular de aproximadamente 14 kDa, se caracterizan por el requerimiento absoluto de iones Ca2+ en concentraciones milimolares para la actividad catalítica, el pH óptimo está en el rango de 7-9.
Actualmente se han descrito diez tipos de PLA2 secretora (IB, IIA, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, X, XII), que se diferencian en la estructura primaria y ubicación de los puentes disulfuro. Todos los tipos de fosfolipasas secretoras son proteínas globulares ricas en cisteína (5-8 puentes disulfuro), lo que asegura la estabilidad de la enzima, incluida la resistencia a la proteólisis y la desnaturalización. La enzima no muestra selectividad por la composición de ácidos grasos de los fosfolípidos, pero hidroliza preferentemente los fosfolípidos cargados negativamente (ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol).
Durante mucho tiempo sólo se conocía una PLA2, que se encuentra abundantemente en el líquido pancreático (tipo IB). En 1989 se descubrió y clonó la fosfolipasa tipo IIA, que se almacena en los gránulos secretores de las plaquetas y cuya concentración aumenta significativamente en los lugares de inflamación, como el líquido sinovial de la artritis reumatoide. Estas proteínas son muy similares a las proteínas del veneno de serpiente. Entre las proteínas de los venenos de abejas y lagartos se descubrieron otras fosfolipasas, que se clasifican en el tipo III. En los mamíferos, una proteína correspondiente a este tipo no se descubrió hasta el año 2000... En 1994 comenzó un nuevo período en la investigación de las fosfolipasas secretoras, cuando se descubrieron las proteínas de tipo IIC y V. Este descubrimiento llevó a una revisión del papel de esta familia. de proteínas en la regulación de las funciones celulares y una búsqueda intensiva de nuevas proteínas similares. Se descubrieron proteínas de los tipos X, IID, IIE y IIF, XII.
Todas estas proteínas (excepto la proteína tipo III) tienen un peso molecular de 14 a 17 kDa, contienen una histidina en el sitio catalítico y exhiben actividad fosfolipasa en presencia de concentraciones milimolares de calcio. Tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadas en la región catalítica (DXCCXXHD) y la región del bucle de unión al calcio (XCGXGG), así como entre 6 y 8 puentes de sulfuro conservados. El centro activo también contiene aspartato que, junto con el bucle de unión al calcio, actúa como una bolsa para el ion Ca2+.
Las enzimas de esta familia no muestran especificidad ni por el grupo asociado con el residuo de ácido fosfatídico ni por el grupo catilo en la posición sn-2. La presencia de formas oxidadas de ácidos grasos en los fosfolípidos aumenta la actividad de las fosfolipasas secretoras, lo que sugiere su participación en la regulación de la viscosidad de la membrana durante el estrés oxidativo. Del análisis estructural por rayos X de los dos primeros grupos de proteínas se desprende que existe un canal hidrófobo en el que entra la molécula de fosfolípido después de la unión interfacial de la proteína a la superficie del fosfolípido.
La PLA2 secretora está contenida constitutivamente en diversas células implicadas en el desarrollo de respuestas inmunes e inflamatorias: macrófagos, mastocitos, fibroblastos y tejidos de órganos como el hígado, el bazo, el timo, la médula ósea y los intestinos. La actividad de la enzima a nivel celular está regulada debido a su inducción por diversos estímulos inflamatorios (interleucina-1 e interleucina-6, factor de necrosis tumoral, lipopolisacárido, interferón-g, ésteres de forbol, factor de crecimiento nervioso). De acuerdo con la inducción por diversos estimulantes, el promotor del gen IIA contiene las secuencias de nucleótidos TATA y CAAT, así como secuencias de unión para factores de transcripción como AP-1, C/EBP, CREB, NF-kB, STAT, PPA Rg. En algunas células, la expresión de PLA2 depende de la activación preliminar de la fosfolipasa citosólica PLA2a, y se supone la participación de productos de la vía 12/15-lipoxigenasa en el proceso de regulación de la fosfolipasa IIA. Los glucocorticoides (antiinflamatorios esteroideos) son supresores de la expresión de fosfolipasa IIA.
Los cambios en la expresión de la fosfolipasa IIA están asociados en muchos casos con la modulación de la rama de prostaglandinas de la cascada del ácido araquidónico. Así, la estimulación con interleucina-1 y factor de necrosis tumoral activó tanto la síntesis de la secreción de fosfolipasa como la síntesis de prostaglandina E2 y prostaciclina en células mesangiales o endoteliales, respectivamente. Cuando se agregaron anticuerpos contra la fosfolipasa a las células, la síntesis de prostaciclina se suprimió parcialmente. De los resultados obtenidos en los últimos años se desprende que las fosfolipasas secretoras (IIA y similares V, X) están implicadas en los procesos de producción tanto rápida como retardada de ácido araquidónico y prostanoides.
Cabe señalar que la adición de fosfolipasas secretoras al entorno extracelular conduce a la liberación activa de ácido araquidónico y a la síntesis de prostanoides por parte de las células activadas, pero prácticamente no tiene ningún efecto sobre la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana de las células en reposo.
Además del papel de la enzima responsable de la presencia de ácido araquidónico, las fosfolipasas secretoras pueden actuar como sustancias fisiológicamente activas. Así, en los mastocitos, inhibidores específicos de las fosfolipasas secretoras redujeron la expresión de la ciclooxigenasa-2 estimulada por el factor de crecimiento nervioso. Al mismo tiempo, los mutantes catalíticamente inactivos de la proteína fosfolipasa también pudieron inducir la expresión de la ciclooxigenasa-2, es decir. este efecto no depende de las propiedades enzimáticas de la fosfolipasa. El mecanismo de este proceso no está claro. Pueden estar implicadas las funciones de la PLA2 secretora como ligando de receptores específicos.
De hecho, en 1995 se demostró que existen proteínas específicas que se unen a la fosfolipasa de tipo IB (la constante de disociación del complejo resultante es 1 nmol/l) y presentan diversos efectos biológicos. Durante los siguientes 10 años, se descubrieron muchas más proteínas, solubles y unidas a membranas, que son capaces de unirse a la fosfolipasa secretora. Sin embargo, sólo una de estas proteínas exhibe las propiedades de un receptor "clásico", que al unirse a un ligando activa el sistema de transmisión de señales intracelulares. Es una proteína de tipo M o sPLA2R. El gen de esta proteína está localizado en el segundo cromosoma; la secuencia de la proteína tiene una homología del 75% entre varias especies de mamíferos; el gen tiene 1 copia y no es de ninguna manera similar a otros genes. La proteína tiene un peso molecular de 180-200 kDa, una parte importante de ella se encuentra en la región extracelular y una secuencia de 40 residuos de aminoácidos se encuentra en el citosol. La proteína sin esta región citosólica se presenta en forma soluble y se muestra su papel como inhibidor de los efectos de las fosfolipasas secretoras. En los seres humanos, la proteína se expresa en el páncreas, los pulmones y las caderas. Se ha demostrado el importante papel de la activación de este receptor en el desarrollo del shock endotóxico.
La figura muestra un diagrama de la participación del receptor secretor de fosfolipasa en la implementación del papel biológico de la enzima a nivel celular.
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El diagrama muestra cómo las formas activas de fosfolipasa sPLA2-IB o sPLA2-X exhiben su actividad enzimática, lo que conduce a la aparición de mediadores lipídicos, y también son ligandos de alta afinidad por el receptor localizado en la membrana plasmática. La interacción de la fosfolipasa con un receptor de membrana conduce a la inducción de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la correspondiente vía de señales intracelulares, que estimula diversas respuestas celulares: proliferación y migración celular, síntesis de sustancias fisiológicamente activas. Cuando se pierde el contacto con la membrana, el receptor conserva la capacidad de unirse a la fosfolipasa, lo que permite regular la actividad de esta última como enzima y como ligando.
Por tanto, las fosfolipasas secretoras desempeñan un papel importante en el desarrollo y propagación de procesos inflamatorios en el organismo. La expresión de fosfolipasas secretoras aumenta significativamente en una variedad de enfermedades inflamatorias. Por este motivo, se están desarrollando inhibidores selectivos de la actividad enzimática de las proteínas de esta familia como una posible nueva clase de sustancias antiinflamatorias. Para buscar inhibidores de las fosfolipasas secretoras, el uso de métodos de modelado por computadora es prometedor, ya que estas proteínas de bajo peso molecular (su peso molecular es de aproximadamente 14 kDa) se obtuvieron en estado cristalino y se conocen sus estructuras tridimensionales. Hay motivos para creer que en los próximos 5 a 10 años, según los resultados de estos estudios, se crearán nuevas tecnologías terapéuticas y nuevos medicamentos.
2.2.3 PLA2 independiente del calcio
La PLA2 clásica independiente de calcio (iPLA2-VIA) existe en forma voligomérica y tiene varias variantes de empalme, al menos dos de las cuales (VIA-1 y VIA-2) tienen actividad enzimática. La proteína iPLA2-VIA-1 tiene un peso molecular de 85 kDa; contiene 8 repeticiones de anquirina en la región N-terminal, un dominio catalítico con una secuencia de aminoácidos característica GXSXG, donde S - serina-465 actúa como centro de catálisis. También hay una secuencia de unión a ATP GXGXXG. Cerca del extremo C (en la región de los residuos de aminoácidos 694-705) hay una región de unión para calmodulina. La formación de un complejo de la proteína iPLA2-VIA con calmodulina activada (es decir, en presencia de iones Ca2+) conduce a la inactivación de esta fosfolipasa. Aunque ambas formas de empalme VIA-1 y VIA-2 tienen secuencias de unión a ATP, se ha demostrado que sólo iPLA2-VIA-2, pero no iPLA2-VIA-1, se activa varias veces en presencia de ATP.
Las repeticiones de anquirina se encuentran en varios cientos de proteínas, como factores de transcripción y reguladores del ciclo celular. Se cree que este motivo está implicado en las interacciones proteína-proteína. Se supone que la proteína iPLA2-VIA está presente en las células como un tetrámero y, posiblemente, motivos de anquirina estén involucrados en la oligomerización de proteínas. La fosfolipasa iPLA2-VIA no es específica de la naturaleza del ácido graso en la posición sn-2 ni del sustituyente en la posición sn-3 del fosfolípido; Es completamente activo en ausencia de calcio y realiza catálisis por transferencia de fase. La enzima también exhibe actividad lisofosfolipasa en la posición sn-1, actividad transacilasa y actividad característica de la proteína PAF-AH.
La proteína iPLA2-VIB contiene un motivo de lipasa GVSTG, donde la serina-483 se encuentra en el centro catalítico; motivo de unión a ATP; Motivo de localización de señales en peroxisomas en el extremo C de la molécula. Los extremos C de las moléculas, incluida la repetición de unión a ATP y la región catalítica, de las proteínas iPLA2-VIB e iPLA2-VIA son similares. Se observan diferencias en el extremo N de la proteína, donde la proteína iPLA2-VIB tiene motivos no tanquirinos, muchos residuos de serina y treonina, algunos de los cuales pueden ser fosforilados por las proteínas quinasas A y C. También hay cinco Ser-Pro regiones que son objetivos de las prolina quinasas. Una de estas secuencias (PTSP, residuos 269-272) es un sitio de fosforilación por proteínas quinasas activadas por mitógenos. La actividad de esta isoforma no depende de los iones de calcio. La presencia de diferentes sitios de fosforilación en las proteínas del grupo iPLA2-VI indica que las funciones de las proteínas iPLA2-VIA e iPLA2-VIB en las células pueden diferir. Ambas fosfolipasas independientes del calcio (iPLA2-VIA e iPLA2-VIB) son proteínas unidas a membrana.
2.3 Especificidad del sustrato
La catálisis por acción de PLA2 se caracteriza por la especificidad superficial, posicional y estérica de la enzima. La fosfolipasa cataliza la reacción en la interfaz lípido/agua. Por un lado, para la mayoría de las enzimas lipolíticas, incluida la PLA2, la actividad enzimática es significativamente mayor cuando los sustratos existen en forma de agregados (micelas, micelas mixtas, monocapas y bicapas) que cuando actúan sobre sustratos solubles en agua en forma monomolecular.
Por otro lado, PLA2 no actúa sobre las moléculas de lípidos en agregados de lípidos densamente empaquetados y, por lo tanto, de difícil acceso. Para crear una interfaz de fase en estos casos se suelen utilizar detergentes (Triton x-100, desoxicolato de sodio). Se ha demostrado que para una manifestación óptima de la especificidad de superficie de la enzima, es necesaria la presencia de sustratos agregados con una determinada longitud de cadena de acilo.
Con el descubrimiento de la especificidad estérica y posicional de PLA2, se formularon requisitos mínimos bastante estrictos de la enzima para el sustrato: en la posición sn-2 del residuo de glicerol, el lípido debe contener un grupo éster, y en la posición sn-3 posición: un grupo fosfato. Más tarde se demostró que el residuo de ácido fosfórico se puede reemplazar por ácido sulfónico: el sulfolípido resultó ser un buen sustrato para PLA2, los fosfolípidos correspondientes, donde el enlace C-O-P es reemplazado por un enlace C-P, también son hidrolizados por la enzima. pero en menor medida. Por lo tanto, los requisitos mínimos de la enzima para el sustrato actualmente se reducen al hecho de que el glicerofosfolípido tiene una configuración L natural y tiene un enlace éster en la posición sn-2 del glicerol, y también contiene un grupo con fuertes propiedades aniónicas en una distancia de cinco a seis átomos del carbono carboxilo. Se cree que el grupo fosfato debe tener una función de ácido libre.
En un fosfolípido con dos enlaces éster sensibles, el difosfatidilglicerol (cardiolipinas), ambos pueden hidrolizarse. Se descubrió que las β-lecitinas (1, 3-diacil-sn-glptsero-2-fosfocolina) son hidrolizadas por PLA2 de la serpiente Crotalusadaincniteus, aunque a una velocidad relativamente baja, PLA2 no hidroliza el enlace amida de los esfingolípidos. Los análogos tiólicos de las fosfatidilcolinas son buenos sustratos, lo que permite controlar espectrofotométricamente el proceso de hidrólisis. De Haas et al. descubrieron que una carga negativa en el grupo fosfato no es un requisito absoluto para el sustrato.
Debido a su especificidad estérica y posicional, PLA2 es una herramienta valiosa en química y bioquímica de lípidos. Se utilizan para establecer la distribución posicional de ácidos grasos en el análisis de fosfoglicéridos, para separar mezclas racémicas de lípidos, así como en la síntesis de lípidos para obtener fosfoglicéridos con una composición mixta de ácidos grasos.
La especificidad del sustrato de la PLA2 celular aún no se ha delineado completamente; sin embargo, se han acumulado datos sobre la estructura de los sustratos de las células PLA2 en la sangre y el sistema inmunológico, en particular, la especificidad de estas enzimas por las fosfatidilcolinas que contienen araquidonato en la sangre; Se ha demostrado la posición 2 del glicerol.
2.4 inhibidores de PLA2
2.4.1 Inhibidores no competitivos
Puede producirse una disminución en la actividad catalítica de PLA2 debido a un desequilibrio en una o varias etapas de la reacción enzimática, por lo que los inhibidores conocidos de esta enzima se pueden dividir a grandes rasgos de la siguiente manera.
a) La unión por un inhibidor enzimático (E) puede desplazar el equilibrio E↔E* hacia la izquierda y reducir la concentración de E* catalíticamente activo. Esto ocurre cuando las vesículas del sustrato se complementan con vesículas de un análogo no hidrolizable del sustrato, al que se une la enzima pero no se puede desorber rápidamente. La necesidad de la presencia de iones de calcio durante la unión de PLA2 a la superficie interfacial da motivos para clasificar los agentes quelantes, como el EDTA, como inhibidores.
b) Los compuestos lipófilos cambian las propiedades de fase de los sustratos y reducen la densidad de carga en la superficie de la interfase, desplazando el equilibrio E↔E* hacia la izquierda. Se ha demostrado que tales cambios son causados ​​por disolventes orgánicos, detergentes, alcoholes, así como por anfífilos catiónicos, fenotiazinas y anestésicos locales de diversa naturaleza química. Otros inhibidores (ácidos grasos, mepacrina, ácido aristolóquico) también afectan la etapa de unión-desorción de E↔E* sin afectar el efecto catalítico de la enzima en la superficie interfacial.
c) Algunos tipos de inhibición inespecífica. En determinadas condiciones, la tasa de hidrólisis bajo la influencia de PLA2 de los fosfolípidos que han sufrido peroxidación aumenta significativamente. Por lo tanto, se considera que los antioxidantes tienen el potencial de reducir la actividad enzimática. Proteínas como la lipocortina y la calpactina solubilizan los fosfolípidos de la superficie interfacial, reduciendo así la actividad de PLA2. Los aniones solubles en agua, como la heparina, inhiben la unión de PLA2 a la interfaz al bloquear el sitio de unión aniónico de la enzima.
d) Modificaciones covalentes de residuos de aminoácidos de PLA2. La 1-bromoctan-2-ona y el bromuro de n-bromofenacilo se unen covalentemente a His-48 en el centro catalítico de la enzima e inhiben completamente la actividad catalítica; la tasa de dicha modificación se reduce significativamente cuando la enzima ya está unida a la superficie interfacial. Los dialdehídos como el gosipol modifican los grupos amino de los residuos de lisina PLA2 responsables de su unión interfacial; la tasa de modificación aumenta en el caso de una enzima ya asociada con la superficie interfacial. La manoalida terpenoide no esteroidea, aislada de una esponja marina, y su análogo sintético actúan de manera similar.
e) Otras conexiones. Presumiblemente, muchos otros compuestos, incluidos algunos fármacos, inhiben la actividad de la PLA2 in vivo; sin embargo, el mecanismo de su acción inhibidora aún no se ha dilucidado. Entre estas sustancias se encuentran los bioflavonoides y retinoides, los ácidos hidroxieicosatetraenoicos, el fenofetol (agonista del receptor β-adrenérgico), el mesilato de gabexato, la nisergolina, la papaverina, la cinarizina y la amperona.

2.4.2 Inhibidores competitivos
Los inhibidores competitivos de PLA2 son análogos de sustratos, productos de reacción o complejos de estados de transición. Compiten con el sustrato por unirse al centro activo de la molécula E*, reduciendo efectivamente la concentración del complejo ES*. Este mecanismo de inhibición se confirmó experimentalmente al estudiar la catálisis de fosfolípidos bajo la influencia de PLA2 según el tipo "scooting".
Una estrategia común para crear inhibidores es reemplazar el enlace éster sensible a PLA2 con un grupo no hidrolizable. En este caso, el inhibidor debe seguir siendo un análogo estructural cercano del sustrato y no provocar cambios en las membranas lipídicas. Por el momento, no es posible comparar los datos disponibles sobre inhibidores competitivos, ya que aún no se ha desarrollado una teoría unificada y una descripción cuantitativa de la lipólisis en la interfaz lípido/agua.
Aminoacilfosfolípidos. Entre las fosfatidilcolinas con modificación del enlace éster sn-2, se descubrió una clase de potentes inhibidores competitivos de PLA2: los análogos de sn-2-amida. Reemplazar el enlace sn -2-éster por un enlace éter o por un residuo de hidrocarburo también resultó en una inhibición competitiva de PLA2, pero en menor medida.
El efecto de los análogos de aminoacilo de los fosfolípidos sobre la actividad enzimática de PLA2 se estudió principalmente en experimentos modelo con micelas mixtas en las siguientes condiciones:
1) la concentración total de lípidos (inhibidor y sustrato) [I] + [S] debe ser constante para calcular la fracción molar del inhibidor, α = [I]/([I] + [S]);
2) las moléculas de sustrato e inhibidor deben ocupar la misma área en la superficie interfacial;
3) la superficie interfacial de las micelas debe ser lo suficientemente grande como para que la enzima esté únicamente en forma unida.
Para evaluar el efecto del inhibidor sobre la actividad de PLA2, se utilizó el valor condicional de la fuerza inhibidora (Z), que es una medida de la relación de las constantes de disociación interfacial del sustrato y el inhibidor y está determinada por la expresión :

Rv= Yo + αZ,
donde Rv es la relación entre la velocidad de reacción en K≠Km y la velocidad de reacción en Ki=Km, α es la fracción molar del inhibidor en la micela.
También se estudió el efecto inhibidor de los análogos de (R)-1-alquil-2-acilamino-1,2-didesoxiglicero-3-fosfocolina sobre las fosfolipasas pancreáticas de mamíferos. Entre los inhibidores saturados con cadenas de ácidos grasos, los análogos con cadenas de acilo C10 tuvieron la mayor actividad. El comportamiento de los análogos insaturados fue más complejo tanto en los inhibidores zwitteriónicos como en los aniónicos; un aumento en el número de dobles enlaces cis en su ubicación particular en la cadena vacilo condujo a un aumento en el parámetro Z.
En el curso de estudios con análogos de tioamida de sustratos, resultó que el análogo de tioamida de la fosfatidiletanolamina con lC50 = 4,5 * 10-7 M es el inhibidor de PLA2 más potente conocido.
Los estudios realizados con inhibidores de aminoacilo han revelado varios aspectos de la interacción enzima/lípido:
1) La introducción de un residuo de amida en la posición sn-2 de un fosfolípido aumenta significativamente su unión al centro catalítico de PLA2: cuanto más oxígeno nucleofílico del grupo amida puede interactuar más fuertemente con el electrófilo de este centro (presumiblemente Ca2+). El grupo amida también ofrece mejores oportunidades para la formación de enlaces de hidrógeno.
2) El grupo α-metileno del residuo acilo en la posición sn-2 del fosfolípido es responsable de la unión del fosfolípido al centro catalítico de la enzima.
3) Un aumento de la hidrofobicidad del grupo funcional en la posición sn-1 del fosfolípido aumenta la afinidad entre la enzima y el sustrato.
4) Las fosfatidiletanolaminas resultaron ser inhibidores más potentes que las fosfatidilcolinas.
El enfoque para la síntesis de 1-acil-2-acilamino-2-desoxiglicerofosfocolinas ópticamente activas se basa en mantener la quiralidad del compuesto de partida (L-serina) durante toda la síntesis. La secuencia seleccionada de introducción de sustituyentes implica el uso de un. número mínimo de grupos protectores. También se ha desarrollado un método estereoespecífico para la síntesis de 1-alquil-2-acilamino-2-desoxiglicerofosfocolinas a partir de L-serina. La introducción de un grupo alquilo alifático se lleva a cabo mediante la interacción de un metanosulfonato de ácido graso con un desoxiglicérido protegido con oxazolina. Se propuso obtener análogos acilamino de cadena larga racémicos de fosfolípidos a partir de 2-aminopropanol. Se describe la síntesis de un análogo de tioamida ópticamente activo de fosfatidilcolina.
Análogos de ftarcetona. Anteriormente se ha establecido que los análogos de sustrato que contienen grupos cetona polarizados, incluidos los grupos fluorocetona y 1,2-dicetona, inhiben las enzimas hidrolíticas. El mejor inhibidor fue una fosfoetanolamina sustituida con un solo residuo acilo, a pesar de que la enzima prefiere sustratos con dos residuos acilo.
Dado que el grupo difluorocetona se hidrata fácilmente en una solución acuosa, los inhibidores se asemejan en estructura al intermedio tetraédrico que se forma durante la lipólisis.
Entre los análogos de las fluorocetonas, se han encontrado inhibidores selectivos de la PLA2 citosólica intracelular. Estos inhibidores resultaron ser análogos de cetonas electrofílicas del ácido araquidónico.
El inhibidor más potente fue la α-trifluorometilcetona del ácido araquidónico. La estructura del complejo de esta sustancia con PLA2 se analizó mediante espectroscopía de RMN 19F y 13C. Los resultados confirmaron la hipótesis de que la unión al centro activo de la enzima forma un hemicetal con un residuo de serina o treonina de la molécula de proteína, debido a la capacidad de las α-fluorocetonas para hidratarse fácilmente en soluciones acuosas.
Análogos de fosfato. Para estudiar la naturaleza de la inhibición de PLA2 de diversas fuentes y el efecto de los sustituyentes sobre la capacidad inhibidora, se sintetizaron más de 100 análogos sn-2-fosfato de fosfatidilcolinas. Los compuestos de esta clase inhibieron sólo la enzima ya asociada con la superficie interfacial y no tuvieron ningún efecto sobre la desorción de la enzima. Los inhibidores de fosfato se unen al centro activo de la enzima a través del ion calcio mediante el enlace de coordinación E-Ca... O=P, compitiendo con los sustratos. Esta interacción está modulada por sustituyentes en la molécula inhibidora. La sustitución del átomo de O en este complejo por S, NH2, el grupo 0=P por O=C-O y la presencia de un grupo fosfato cargado negativamente redujeron significativamente la afinidad por la enzima. La capacidad inhibidora de los fosfoésteres dependía estrictamente de características estereoquímicas y estructurales: la quiralidad de la posición sn-2, la longitud de la cadena alquílica en la posición sn y la presencia de un sustituyente hidrófobo en la posición sn-3 del glicerol. . Los análogos de fosfomonoéster dianiónico que contienen sulfonato, amida, oxima no mostraron propiedades inhibidoras.
Alquilfosfotidilcolinas. Para uso farmacológico, aparentemente, las sustancias más prometedoras son aquellas que pueden inhibir la PLA2 sin alterar la organización estructural de la membrana. De particular interés a este respecto son los lípidos con un enlace éter. En las moléculas de lípidos de esta clase, los sustituyentes hidrófobos están unidos al residuo hidrófilo a través de un enlace éter PLA2 no hidrolizable. Al mismo tiempo, en su composición, los lípidos de membrana con enlace éter prácticamente no se diferencian de sus análogos diacilo. Estudiamos el efecto de las fosfatidilcolinas unidas a éter de cadena larga sobre la destrucción de membranas bajo la influencia de PLA2 mediante espectroscopia P-NMR y evaluamos la posibilidad de utilizar lípidos en reacciones inflamatorias locales.
Se obtuvieron resultados casi idénticos para los inhibidores estudiados: la introducción en la bicapa lipídica de compuestos de fosfatidilcolina de huevo en una proporción molar de 1: 1 condujo a una estabilización de la membrana tan eficaz que no se observaron reordenamientos estructurales bajo la influencia de esta enzima.
Entre los fosfolípidos de esta clase se encontraron inhibidores de la PLA2 citosólica, que tienen propiedades antiinflamatorias y antialérgicas.

2.5 Importancia para el organismo en caso de alteración de la actividad
La activación excesiva de PLA2 es importante en la patogénesis del daño celular. Los ácidos grasos insaturados (araquidónico, pentanoico, etc.) liberados bajo la acción de la fosfolipasa se consumen para formar compuestos fisiológicamente activos: prostaglandinas y leucotrienos. La parte restante de la molécula de fosfolípido (lisofosfolípido) tiene una sola “cola” de ácido graso, por lo que tiene la capacidad de formar micelas y es un detergente muy fuerte. El daño a las membranas celulares en condiciones de activación excesiva de PLA2 se asocia con el efecto detergente de los lisofosfolípidos.
Propiedades farmacológicas y tóxicas de la fosfolipasa debido a su actividad bioquímica. Con la ayuda de su lisolecitina tóxica, descompone la sangre y las estructuras de los tejidos, dañando sus membranas celulares y orgánulos. La fosfolipasa reduce la coagulación sanguínea al destruir los componentes que promueven la coagulación que contienen fosfolípidos. Daña las membranas mitocondriales, y estas últimas son un importante orgánulo celular, portador de sistemas enzimáticos complejos. Participan en el metabolismo y los procesos redox. El daño a la estructura de fosfolípidos de las fibras nerviosas probablemente sea causado por la fosfolipasa, que bloquea la conducción entre el tejido nervioso y muscular.
La introducción de fosfolipasa debajo de la piel provoca inflamación local; la administración intravenosa se acompaña de una disminución de la presión arterial en animales de experimentación, edema pulmonar y hemorragias en los alvéolos. En animales que han sobrevivido durante varias horas, se detecta en la orina hemoglobina de los glóbulos rojos destruidos. Además, se encontró que la fosfolipasa del veneno de abeja, inyectada por vía subcutánea, mejora el desarrollo de procesos inflamatorios modelo de diversas etiologías.
Se ha sugerido que, a través de su efecto reductor de la tensión superficial, la melitina prepara los fosfolípidos para la actividad enzimática de la fosfolipasa. De todos los componentes del veneno de abeja, la fosfolipasa es el irritante antigénico y alergénico más potente. La sangre de los apicultores inmunes al veneno de abeja contiene anticuerpos con un título alto contra el veneno. Los pacientes hipersensibles al veneno de abeja mostraron una reacción aguda a la fosfolipasa durante las pruebas de laboratorio para detectar alergias.
Las propiedades tóxicas y alérgicas de la fosfolipasa que potencian los procesos inflamatorios la caracterizan como un componente del veneno de abeja nocivo para el cuerpo humano.
La activación de PLA2 depende del calcio. Ocurre cuando se estimulan las células suprarrenales, lo que conduce a una aceleración del recambio de araquidonilfosfatidilinositol. Este efecto también es causado por un ionóforo de calcio y puede reflejar un aumento en los niveles de calcio intracelular y una estimulación secundaria de PLA2 como una reacción temprana que acompaña a la interacción del receptor. Se sabe que el efecto de la nasteroidogénesis en las glándulas suprarrenales depende del calcio y no sólo de la formación de AMPc. Al menos parte del requerimiento de calcio puede estar relacionado con el recambio de fosfolípidos de membrana comediado por PLA2 durante la activación de la corteza suprarrenal.
El mecanismo, incluida la activación de la fosfolipasa, puede reflejar una propiedad general de las células secretoras reguladas por hormonas; con la estimulación hormonal de células diana específicas, también cambian otras etapas del metabolismo de los fosfolípidos, en las que la LH aumenta la producción de prostaglandinas. , la hormona no aumenta la formación de ácido araquidónico, pero actúa en etapas posteriores, aumentando la actividad de la prostaglandina sintetasa. Este efecto de la LH sobre la síntesis de prostaglandinas en el folículo de Graaf (folículo ovárico vesicular) no parece mediar los efectos esteroidogénicos de la gonadotropina, pero desempeña un papel importante en el desarrollo de la ovulación.
2.6 Uso de PLA2 en medicina
La PLA2 secretora se considera uno de los factores patogénicos en la formación de una serie de enfermedades: artritis reumatoide, aterosclerosis. En los últimos años ha surgido información sobre la implicación de esta enzima en la patología pulmonar. De particular interés es la cadena patogénica “sPLA2 – síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) – surfactante pulmonar”.
El síndrome de dificultad respiratoria aguda en adultos se produce como resultado tanto de efectos directos sobre los pulmones (aspiración, inhalación de sustancias tóxicas, oxígeno al 100%, ventilación mecánica insuficientemente calificada) como de efectos indirectos (sepsis, shock de cualquier etiología, politraumatismo, pérdida de sangre). . A pesar de años de investigación intensiva, el mecanismo de desarrollo del SDRA sigue sin estar claro y su tasa de mortalidad es alta (~50%). Se cree que el origen de esta afección pulmonar es una disminución en la producción y actividad del surfactante.
El surfactante pulmonar es un complejo de lipoglicoproteínas que es sintetizado por los alveolocitos tipo II. Se compone de un 80-90% de fosfolípidos, un 5-10% de lípidos neutros y un 5-10% de proteínas. Además de las propiedades tensioactivas necesarias para la respiración normal, tiene efectos antiinflamatorios e inmunorreguladores. La violación de su integridad conduce a un aumento de la tensión superficial no solo en los alvéolos, sino también en los bronquiolos y los bronquios pequeños.
La especificidad de sustrato de la PLA2 citosólica hacia los sustratos que contienen araquidonoilo sugiere que esta isoforma desempeña un papel importante en la patogénesis del asma. Se sabe que los leucotrienos B4, C4, D4, E4 son el principal grupo de mediadores implicados en el complejo proceso inflamatorio y que conducen a las manifestaciones clínicas del asma. La acción de los leucotrienos es contraer el músculo liso bronquial, aumentar la cantidad de moco producido, estimular la permeabilidad vascular y la formación de edema. Todos estos signos son característicos del asma. Los leucotrienos se sintetizan en respuesta a la exposición a un alérgeno o a una reacción inespecífica que conduce a la activación de cPLA2.
Chilton F.H. estudió la presencia de productos con actividad fosfolipasa en el líquido de lavado broncoalveolar de pacientes con asma 5 a 30 minutos, 6 y 20 horas después de la exposición al antígeno. La concentración de lisoproductos fue 7 veces mayor en comparación con el grupo de control. Por lo tanto, se sugirió que la hidrólisis de los fosfolípidos tensioactivos conduce a la generación de lisofosfatidilcolina citotóxica, que puede tener un efecto detergente directo sobre la membrana e influir en la actividad de los canales y proteínas de la membrana. Además, al transformarse en factor activador de plaquetas, provoca alteración de la permeabilidad de la barrera alveolar-capilar, broncoespasmo y agregación plaquetaria.
También se supone que cPLA2 está implicada en la aparición y desarrollo de la fibrosis pulmonar, una lesión intersticial del parénquima pulmonar actualmente poco conocida. La patogénesis de esta afección incluye producción excesiva de mediadores proinflamatorios, inflamación alveolar, proliferación de fibroblastos y acumulación de colágeno. El modelo experimental clásico para esta afección es la fibrosis pulmonar inducida por la administración intratraqueal o intraperitoneal de bleomicina.
El papel de la fosfolipasa en el desarrollo de algunas formas de pancreatitis es importante.
Con insuficiencia de la papila duodenal mayor y aumento de la presión en el duodeno, es posible el reflujo de bilis o contenido duodenal hacia los conductos pancreáticos. La bilis, que ingresa a los conductos pancreáticos, puede quedar expuesta a la fosfolipasa pancreática, ya activada por la tripsina, lo que resulta en la formación de lisolecitina que, al penetrar en el espacio intersticial del páncreas, causa un daño profundo en las células.
Además, la Dra. Heidi May demostró que la PLA2 asociada a lipoproteínas predice el riesgo de muerte coronaria.
La información obtenida en los últimos años sobre la participación de la PLA2 citosólica y secretora en la formación de patología pulmonar abre la perspectiva de nuevos enfoques para el tratamiento de tales enfermedades. Sin embargo, primero es necesario definir claramente el lugar de estas enzimas en la cadena patogénica de eventos moleculares. Aquí el enfoque “sindrómico” puede ser importante. Por ejemplo, todavía no hay información sobre el estado de PLA2 durante la hipertermia y la hipoxia, o durante la activación de las células productoras. Mientras tanto, la mayoría de las enfermedades pulmonares se caracterizan por estas condiciones, que determinan en gran medida el cuadro clínico, el curso y el resultado del proceso patológico.
2.7 Papel biológico del PLA2
Hasta la fecha, la PLA2 secretada por los venenos de los mamíferos y las glándulas pancreáticas se ha caracterizado y estudiado suficientemente. Por el contrario, las concentraciones relativamente bajas in vivo de PLA2 intracelular y extracelular no pancreática complican seriamente los estudios de esta clase de enzimas.
Se ha establecido que la PLA2 unida a membranas desempeña un papel importante en los procesos reguladores del metabolismo celular. Se conocen varias vías para la regulación de estas enzimas, pero el mecanismo general es muy complejo y no se comprende completamente. PLA2 participa en la transmisión de señales químicas a través de las membranas en respuesta a influencias externas. La enzima hidroliza eficazmente los fosfolípidos que contienen peróxidos de ácidos grasos, restaurando las propiedades estructurales y funcionales de las membranas celulares. Al parecer, un cambio en la conformación molecular de los lípidos oxidados facilita el acceso de la enzima al enlace sn-2-éster.
Hoy se ha establecido que las fosfolipasas A2 desempeñan un papel importante en el desarrollo del proceso inflamatorio. La contribución de la enzima es desencadenar la síntesis de lípidos reguladores de esta reacción, uno de los grupos de los llamados mediadores químicos de la inflamación. Se forman, activan o movilizan en el foco inflamatorio y su relación determina la naturaleza del proceso patológico. Los mediadores inflamatorios lipídicos están representados por los ácidos grasos y sus derivados (prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos), así como por el factor activador de plaquetas fosfolípidos (PAF). Se cree que la PLA2 citosólica intracelular participa en el proceso inflamatorio, liberando ácidos polienoicos de la posición sn-2 del residuo de glicerol de los fosfolípidos de membrana, incluido el ácido araquidónico, que tienen su propia actividad biológica, incluido. Aumenta la permeabilidad vascular, provoca agregación plaquetaria y tiene un efecto vasoactivo.
Otros productos de la reacción de hidrólisis de la fosfolipasa son los lisofosfolípidos, que tienen propiedades detergentes y de citotoxicidad pronunciadas. Estos compuestos se encuentran en enfermedades como colecistitis, infarto de miocardio, cataratas, psoriasis, etc. Cuando se libera un ácido graso de la fosfatidilcolina de tipo 1-O-alquilo, el lisofosfolípido resultante sirve como precursor del PAF, un mediador de la inflamación, reacciones alérgicas, shock séptico y afecciones asmáticas. Actualmente, este compuesto se está estudiando intensamente; se han dedicado una gran cantidad de publicaciones a los agonistas y antagonistas de PAT.
La importancia de la PLA2 unida a la membrana en la regulación celular, así como su elevado nivel en una serie de procesos patológicos, conducen a la necesidad de regular la actividad de esta enzima. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas clases de inhibidores de lípidos y el desarrollo de métodos convenientes para su síntesis son actualmente de interés práctico.

Bibliografía
1. Bragina N.A., Chupin V.V., Bulgakov V.G. Inhibidores lipídicos de la fosfolipasa A2, M., 1999, p. 83-96
2. Brockerhoff X., Jensen R., Enzimas lipolíticas, trad. Del inglés, M., 1978, pág. 242-356

fosfolipasa- una enzima que hidroliza los fosfolípidos. Hay 4 clases principales de fosfolipasas: A, B, C y D, cada una de las cuales hidroliza un enlace específico en el fosfolípido. Las fosfolipasas de clase A se dividen en fosfolipasas A1, que escinden la cadena acilo SN-1 de un fosfolípido, y fosfolipasas A2, que escinden la cadena acilo SN-2. Las fosfolipasas A2 incluyen:

• Fosfolipasas A2 extracelulares de venenos de serpientes, reptiles e insectos.
• fosfolipasa pancreática
• fosfolipasas intracelulares A2

Fosfolipasa pancreática

Fosfolipasa pancreática- fosfolipasa de clase A2 (EC 3.1.1.4), una enzima lipolítica que descompone las grasas alimentarias (triglicéridos). Se secreta en forma de proenzima pancreática profosfolipasa, que se activa en el intestino delgado mediante tripsina (Sablin O.A. et al.). La acidez óptima para la actividad catalítica de la fosfolipasa pancreática es de 7,5 a 9,0 pH. “Funciona” como enzima en presencia de Ca 2+ (que es una coenzima de la fosfolipasa).

Cuando la lecitina biliar se descompone hidrolíticamente mediante la fosfolipasa A, se forma lisolecitina. El metabolismo adicional de la lisolecitina es catalizado por la fosfolipasa B, que es inhibida por los ácidos biliares (Maev I.V. et al.)

El papel de la fosfolipasa en el desarrollo de algunas formas de pancreatitis.

Con insuficiencia de la papila duodenal mayor y aumento de la presión en el duodeno, es posible el reflujo de bilis o contenido duodenal hacia los conductos pancreáticos. La bilis, que ingresa a los conductos pancreáticos, puede quedar expuesta a la fosfolipasa pancreática, ya activada por la tripsina, lo que resulta en la formación de lisolecitina que, al penetrar en el espacio intersticial del páncreas, causa un daño profundo a las células. Índice del tema "Sistema endocrino. Naturaleza química y mecanismos generales de acción de las hormonas":
1. Sistema endocrino. Naturaleza química y mecanismos generales de acción de las hormonas.
2. Mecanismos de acción de hormonas peptídicas, proteicas y catecolaminas. Ligando.
3. Sistemas básicos de intermediarios secundarios. Sistema de adenilato ciclasa - cAMP.

5. Sistema calcio-calmodulina. Interconexiones de intermediarios secundarios.
6. El mecanismo de acción de las hormonas esteroides. Mecanismo de acción genómico.
7. Mecanismo de acción no genómico de las hormonas esteroides.
8. Autorregulación de la sensibilidad efectora a las señales hormonales. Desensibilización (sensibilidad reducida) de la célula.
9. Funciones reguladoras de las hormonas hipofisarias. Adenohipófisis. Neurohipófisis.
10. Irrigación sanguínea de la adenohipófisis y la neurohipófisis.

Sistema guanilato ciclasa-cGMP.

La activación de la guanilato ciclasa de membrana no ocurre bajo la influencia directa. complejo receptor hormonal, pero indirectamente a través de calcio ionizado y sistemas de membranas oxidantes. La estimulación de la actividad de la guanilato ciclasa, que determina los efectos de la acetilcolina, también se produce indirectamente a través del Ca2+. Mediante la activación de la guanilato ciclasa, se realiza el efecto de la hormona natriurética auricular, el atriopéptido. Al activar la oxidación del peróxido, la hormona endotelial de la pared vascular, el óxido nítrico, un factor endotelial relajante, estimula la guanilato ciclasa. Bajo la influencia de la guanilato ciclasa de El GTP es sintetizado por cGMP., activación de proteínas quinasas dependientes de cGMP, que reducen la tasa de fosforilación de las cadenas ligeras de miosina en los músculos lisos de las paredes vasculares, provocando su relajación. En la mayoría de los tejidos, los efectos bioquímicos y fisiológicos del AMPc y del GMPc son opuestos. Los ejemplos incluyen la estimulación de las contracciones cardíacas bajo la influencia del AMPc y la inhibición de las contracciones por el GMPc, la estimulación de la contracción de los músculos lisos intestinales por el GMPc y la inhibición del AMPc. cGMP asegura la hiperpolarización de los receptores de la retina bajo la influencia de fotones de luz. La hidrólisis enzimática del cGMP y, en consecuencia, el cese del efecto hormonal, se lleva a cabo mediante una fosfodiesterasa específica.

Arroz. 6.2. Mediación de señales hormonales por el sistema fosfolipasa C-inositol-3-fosfato.

La formación de un complejo hormona-receptor con la participación de una proteína G reguladora activa la fosfolipasa C de membrana, lo que provoca la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana con la formación de dos mensajeros secundarios: inositol-3-fosfato y diacilglicerol. El inositol-3-fosfato conduce a la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares. La unión del calcio ionizado a la proteína especializada calmodulina activa las proteínas quinasas y provoca la fosforilación de enzimas y proteínas estructurales intracelulares. El diacilglicerol aumenta la afinidad de la proteína quinasa C por el Ca2+, promoviendo su activación, lo que también resulta en la fosforilación de proteínas. Al mismo tiempo, el diacilglicerol implementa otra forma de mediar el efecto hormonal, activando la fosfolipasa A-2 y la formación de prostanoides.

Sistema de fosfolipasa C: inositol-3-fosfato.

Complejo receptor hormonal con la participación de la proteína G reguladora conduce a la activación de la membrana enzima fosfolipasa C, provocando la hidrólisis de los fosfolípidos de membrana con la formación de dos mensajeros secundarios: inositol 3-fosfato y diacilglicerol.Inositol 3-fosfato provoca la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, principalmente del retículo endoplásmico, el calcio ionizado se une a la proteína especializada calmodulina, lo que asegura la activación de las proteínas quinasas y la fosforilación de proteínas y enzimas estructurales intracelulares. A su vez, el diacilglicerol favorece un fuerte aumento de la afinidad de la proteína quinasa C por el calcio ionizado, este último lo activa sin la participación de la calmodulina, lo que también finaliza con los procesos de fosforilación de proteínas. Al mismo tiempo, el diacilglicerol implementa otra forma de mediar el efecto hormonal mediante la activación de la fosfolipasa A-2. Bajo la influencia de este último, se forma ácido araquidónico a partir de fosfolípidos de membrana, que es una fuente de sustancias con potentes efectos metabólicos y fisiológicos: prostaglandinas y leucotrienos. En diferentes células del cuerpo prevalece una u otra vía para la formación de mensajeros secundarios, lo que en última instancia determina el efecto fisiológico de la hormona. A través del sistema considerado de segundos mensajeros, se realizan los efectos de la adrenalina (en combinación con el adrenorreceptor alfa), la vasopresina (en combinación con el receptor V-1), la angiotensina I, la somatostatina y la oxitocina.

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La fosfolipasa A2 (E.F.3.1.1.4.) es una enzima que cataliza la escisión de residuos de ácidos grasos (lecitina, cefalina) de los fosfolípidos, convirtiéndolos en compuestos tóxicos que reducen en gran medida la tensión superficial. Estos compuestos disuelven los glóbulos rojos y otras estructuras celulares y subcelulares y, por lo tanto, se denominan lisolecitinas y lisocefalinas.

En la molécula de fosfolípidos, la fosfolipasa del veneno de abeja separa el ácido graso del segundo lugar de la molécula y, por lo tanto, se llama fosfolipasa A2. Se conoce desde 1897 (Langer) como un factor que potencia la actividad hemolítica del veneno de abeja tras la adición de lecitina. La fosfolipasa es la enzima más estudiada del veneno de abeja. La fosfolipasa fue descubierta como enzima digestiva en 1900. Ahora está claro que la fosfolipasa A2 (PLA2) es más que una enzima digestiva. Está muy extendido y presente en la mayoría de las células y tejidos de los mamíferos, y actúa como regulador del metabolismo, manteniendo la homeostasis de la membrana y la formación de precursores de eicosanoides.

Dependiendo del peso molecular, la localización celular y la presencia de iones Ca2+, se distingue entre PLA2 citosólica, PLA2 secretora e independiente de Ca o PLA2 de membrana externa.

Las PLA2 comprenden varias familias de proteínas no relacionadas con actividades enzimáticas comunes. Las dos familias más importantes son las fosfolipasas A2 secretadas y citosólicas.

PLA2 citosólica:

Las fosfolipasas intracelulares, así como las extracelulares, son enzimas dependientes del calcio. Sin embargo, estructuralmente son muy diferentes de las fosfolipasas secretadas. Normalmente, son mucho más grandes (más de 700 aminoácidos) y contienen un dominio C2, que dirige la enzima a la membrana celular. Estas fosfolipasas participan principalmente en vías de señalización celular como la respuesta inflamatoria. Bajo la influencia de PLA2, se puede formar en la célula ácido araquidónico, un precursor de los eicosanoides, moléculas de señalización activas como los leucotrienos y las prostaglandinas.

Membrana exterior PLA2:

Las bacterias gramnegativas contienen PLA2 en su membrana externa con una amplia gama de especificidad. En Escherichia coli, esta enzima participa en la liberación de la toxina bacteriocina de la célula debido al aumento de la permeabilidad de la membrana con un aumento en el nivel de lisofosfolípidos y ácidos grasos en la membrana.

PLA2 secretada:

Se han aislado formas extracelulares de fosfolipasas de diversos venenos de serpientes, abejas y avispas. También se encuentran en todos los tejidos de los mamíferos y en las bacterias. La actividad de estas fosfolipasas requiere la presencia de calcio.

Fosfolipasa A2 del veneno de abeja en el espacio extracelular cerca de la bicapa lipídica. Los grupos polares de fosfolípidos se encuentran entre los planos amarillo y rojo. Las cadenas de acilo no polares se encuentran entre los planos rojo y negro.

La fosfolipasa pancreática es una enzima digestiva y participa en la digestión de los lípidos alimentarios. Las fosfolipasas del veneno intervienen en la inmovilización de la víctima debido a la lisis de sus células.

La historia de las fosfolipasas citosólicas del grupo A2 comenzó en 1991, cuando del citosol de varias células animales se aisló y clonó una proteína con un peso molecular de 85 kDa, que, además de su peso molecular, se diferenciaba de las fosfolipasas conocidas en ese momento. tiempo en ausencia de puentes disulfuro y sensibilidad al calcio. Posteriormente, el análisis de bases de nucleótidos permitió encontrar dos parálogos más: cPLA2b y cPLA2g. La primera proteína encontrada se denominó cPLA2a. Sin embargo, la enzima, llamada "citosólica", actúa sobre las membranas del retículo citoplasmático y del núcleo. Esta isoforma de PLA2 está presente en muchas células y tejidos: cerebro, riñones, bazo, pulmones, macrófagos, neutrófilos, células epiteliales alveolares, etc. La enzima se activa como resultado de la fosforilación por las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la proteína quinasa C. Diversas citoquinas extracelulares, mitógenos, hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, antígenos, endotoxinas, así como ciertas influencias físicas y estresantes, incluida la luz ultravioleta y el estrés oxidativo, inducen la activación y síntesis de PLA2 citosólica.

Introducción

1. Fosfolipasas

1.1 Clasificación. Propiedades

2. Fosfolipasa A2

2.1 Información general (reacción, descubrimiento, estructura)

2.2 Clasificación y propiedades

2.2.1 PLA2 citosólica

2.2.2 PLA2 secretora

2.2.3 PLA2 independiente del calcio

2.3 Especificidad del sustrato

2.4 inhibidores de PLA2

2.4.1 Inhibición no competitiva

2.4.2 Inhibición competitiva

2.5 Implicaciones para el organismo en caso de deterioro de la actividad

2.6 Uso de PLA2 en medicina

2.7 Papel biológico del PLA2

Bibliografía

Introducción

Las fosfolipasas son enzimas de la clase de las hidrolasas que catalizan la hidrólisis de los fosfoglicéridos. Dependiendo de la posición del enlace hidrolizado en el fosfolípido, existen 4 clases principales de fosfolipasas: A, B, C y D.

Los lisofosfolípidos son escindidos por fosfolipasas L (no se ha demostrado la existencia de fosfolipasas L1 y L2 específicas de posición). Fosfolipasa B es un nombre obsoleto. Fármacos con actividad tipo fosfolipasa A y L.

X - residuo de colina, serina, mioinositol, etc.; para fosfolipasas L1 R2=C(O)R4, R3=H; para fosfolipasas L2 R2=H, R3=C(O)R4

Cada una de las familias de fosfolipasas es heterogénea e incluye enzimas que difieren significativamente en pesos moleculares, composición de subunidades y otras propiedades. Todas las fosfolipasas catalizan más activamente la hidrólisis en la interfaz fosfolípido-agua; Hidrolizar lentamente sustratos solubles en agua.

Fosfolipasa A1- (EC 3.1.1.32, fosfolipasa A1 inglesa) escinde la cadena acilo SN-1.

Fosfolipasa A2- (EC 3.1.1.4, fosfolipasa A2 inglesa) escinde la cadena acilo SN-2.

Fosfolipasa B-(lisofosfolipasa, fosfolipasa B inglesa) escinde las cadenas de acilo SN-1 y SN-2. Fosfolipasa, que tiene las actividades tanto de la fosfolipasa A1 como de A2, es decir, capaz de hidrolizar la cadena acilo de un fosfolípido en las posiciones sn-1 y sn-2.

Fosfolipasa C- (EC 3.1.4.3, fosfolipasa C en inglés) hidroliza el enlace entre el residuo de glicerol del fosfolípido y el grupo fosfato polar, dando como resultado la formación de diacilglicerol y un grupo polar que contiene fosfato.

Fosfolipasa D- (EC 3.1.4.4, fosfolipasa D inglesa) hidroliza el enlace entre el grupo fosfato y el grupo alcohol, liberando ácido fosfatídico y alcohol. Hay 2 isoformas de esta fosfolipasa D1 y D2.

Las fosfolipasas juegan un papel importante en el metabolismo de los lípidos en los organismos vivos. Se utilizan para determinar la estructura de los fosfoglicéridos y su ubicación en las membranas.

1. Fosfolipasas.

1.1 Clasificación. Propiedades

De hecho, se distinguen varias fosfolipasas del grupo A; son parte integral de muchos tejidos y secreciones de organismos vivos.

Fosfolipasa A1 En su mayor parte, las enzimas intracelulares, a menudo unidas a membranas, no requieren coenzima. Sus pesos moleculares varían entre 15.000 y 90.000; la actividad catalítica óptima se produce a pH 4,0 (para enzimas lisosomales) o 8,0-9,5 (para enzimas de microsomas, membranas plasmáticas y citosol); Ampliamente distribuido en tejidos animales (hígado, corazón, cerebro) y en microorganismos (Bacillus subtilis, B. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli).

Las fosfolipasas A1 escinden la cadena acilo del fosfolípido en la posición sn-1. La acción de la fosfolipasa A1 sobre un fosfolípido produce 1-lisofosfolípido y un ácido graso. La fosfolipasa es un componente activo del veneno de serpiente con acción hemolítica.

Fosfolipasa A2- los representantes más estudiados de las fosfolipasas. Se conocen 3 grupos de fosfolipasas A2: 1) enzimas de los venenos de serpientes, reptiles e insectos, que existen en forma de una gran cantidad de isoformas; 2) enzimas del páncreas de los mamíferos, producidas en el organismo en forma de zimógenos (precursores de mayor peso molecular) y activadas por tripsina; 3) enzimas intracelulares de la sangre y los tejidos de los animales, entre las que se encuentran tanto las solubles como las unidas a membranas.

Las fosfolipasas A2 de los dos primeros subgrupos son enzimas solubles en agua con un peso molecular de 11 a 19 mil (algunas son activas en forma de dímeros) y son muy estables debido a una gran cantidad (6-7) de enlaces disulfuro. Actividad catalítica óptima a pH 7,5-9,0; pI de 4,0 a 10,5; coenzima - Ca2+. Para muchos representantes de estos subgrupos de fosfolipasas, se conocen las estructuras primaria y espacial. En el centro activo se encontraron residuos de histidina y ácido aspártico. Las propiedades de las fosfolipasas A2 intracelulares (tercer subgrupo) dependen de la localización subcelular de la enzima. Su peso molecular es de 12 a 75 mil; Actividad catalítica óptima a pH 4,2-9,0. Algunas enzimas de este subgrupo no contienen coenzimas.

Fosfolipasa B aislado de plantas, microorganismos, veneno de abejas y tejidos de mamíferos. Las enzimas de este grupo son extremadamente inespecíficas, catalizan la hidrólisis de varios enlaces éster y tienen un efecto lítico (destructivo) sobre las membranas biológicas (lo que determina su toxicidad). El peso molecular de las fosfolipasas B es de 15 a 65 mil, son menos estables que las fosfolipasas A; su actividad catalítica óptima se produce a un pH de 4,5 (enzima lisosomal) a 10,0 (enzimas venenosas). Las fosfolipasas no tienen coenzimas y no son inhibidas por el ácido etilendiaminotetraacético. Algunas fosfolipasas B son inhibidas por el fluorofosfato de diisopropilo y el ácido p-cloromercurbenzoico. Inhibidores universales de todas las fosfolipasas B - tensioactivos.

La fosfolipasa B es capaz de hidrolizar la cadena acilo de un fosfolípido en las posiciones sn-1 y sn-2. Como regla general, la fosfolipasa actúa sobre la lisolecitina (lisofosfatidilcolina), que se forma como resultado de la acción de la fosfolipasa A1 sobre la lecitina (. fosfatidilcolina).

Fosfolipasa C Se encuentra en las bacterias Clostridium, Bacillus y Pseudomonas, así como en células de mamíferos (hígado, cerebro, páncreas). Algunos de ellos se caracterizan por una especificidad estricta con respecto al grupo alcohol de la molécula sustrato, por ejemplo, al residuo de colina (fosfolipasa Cx) y mioinositol (fosfolipasa C). El peso molecular de las fosfolipasas C es de 23 a 51 mil. Los iones Zn2+ son una coenzima y un estabilizador para ellas. Actividad catalítica óptima a pH alrededor de 7 para fosfolipasas Cx, y a pH< 7 для фосфолипаз Си.

La fosfolipasa C, que hidroliza el enlace fosfodiéster entre el residuo de glicerol del fosfolípido y el grupo fosfato polar, pertenece tanto a las fosfodiesterasas como a la fosfolipasa D. La fosfolipasa C es una enzima clave en el metabolismo del fosfatidilinositol y las vías de señalización de los lípidos.

La fosfolipasa C es activada por las subunidades Gαq o Gβγ de la proteína G. Por lo tanto, es parte de un receptor acoplado a proteína G y una vía de señalización asociada o parte de un receptor transmembrana con actividad tirosina quinasa intrínseca o asociada.

La fosfolipasa C hidroliza el fosfatidilinositol (PIP2) en dos mediadores secundarios, inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). Estos mediadores participan en etapas posteriores de las vías de señalización. En particular, modulan los canales de calcio del retículo endoplásmico y la proteína quinasa C, respectivamente.

Fosfolipasa D pertenece a un grupo de enzimas importantes que en los sistemas vivos realizan una variedad de funciones desde la absorción de nutrientes hasta la síntesis de compuestos biológicamente activos. Se encuentra en plantas (verduras, algas), microorganismos y tejidos animales. Su peso molecular es de 90 a 116 mil. Actividad catalítica óptima a pH 4,7 a 8,0. Los tensioactivos catiónicos inhiben las fosfolipasas D, mientras que los tensioactivos aniónicos las activan.

La fosfolipasa D exhibe principalmente actividad hidrolítica, lo que resulta en la escisión del enlace éster entre el ácido fosfatídico y los residuos de alcohol en las moléculas de fosfolípidos (PL). En este caso, este último se reemplaza por hidrógeno, pero el residuo de ácido fosfatídico se puede transferir a una variedad de aceptores que contienen hidroxilo, lo cual es de gran interés para la biotecnología, ya que la actividad de transfosfatidilación de la fosfolipasa se puede aprovechar para la síntesis de varios drogas.

La fosfolipasa D escinde específicamente la fosfatidilcolina en ácido fosfatídico y colina, liberando este último en el citoplasma.

fosfatidilcolina ácido fosfatídico colina

1.2 Fosfolipasa C - sistema inositol-3-fosfato

La activación de la guanilato ciclasa de membrana no se produce bajo la influencia directa del complejo hormona-receptor, sino indirectamente a través de calcio ionizado y sistemas de membrana oxidantes. La estimulación de la actividad de la guanilato ciclasa, que determina los efectos de la acetilcolina, también se produce indirectamente a través del Ca2+. Mediante la activación de la guanilato ciclasa, se realiza el efecto de la hormona natriurética auricular, el atriopéptido. Al activar la oxidación del peróxido, la hormona endotelial de la pared vascular, el óxido nítrico, un factor endotelial relajante, estimula la guanilato ciclasa. Bajo la influencia de la guanilato ciclasa, el GMPc se sintetiza a partir de GTP, que activa las proteínas quinasas dependientes de GMPc, que reducen la tasa de fosforilación de las cadenas ligeras de miosina en los músculos lisos de las paredes vasculares, lo que lleva a su relajación.

En la mayoría de los tejidos, los efectos bioquímicos y fisiológicos del AMPc y del GMPc son opuestos. Los ejemplos incluyen la estimulación de las contracciones cardíacas bajo la influencia del AMPc y la inhibición de las contracciones por el GMPc, la estimulación de la contracción de los músculos lisos intestinales por el GMPc y la inhibición del AMPc. cGMP asegura la hiperpolarización de los receptores de la retina bajo la influencia de fotones de luz. La hidrólisis enzimática del cGMP y, en consecuencia, el cese del efecto hormonal, se lleva a cabo mediante una fosfodiesterasa específica.