Obsah
Úvod
1. Fosfolipázy
1.1 Klasifikace. Vlastnosti
1.2 Systém fosfolipázy C - inositol-3-fosfát
2. Fosfolipáza A2
2.1 Obecné informace (reakce, objev, struktura)
2.2 Klasifikace a vlastnosti
2.2.1 Cytosolický PLA2
2.2.2 Sekreční PLA2
2.2.3 Na vápníku nezávislý PLA2
2.3 Specifičnost substrátu
2.4 Inhibitory PLA2
2.4.1 Nekompetitivní inhibice
2.4.2 Konkurenční inhibice


2.7 Biologická role PLA2
Bibliografie

Úvod
Fosfolipázy (angl. fosfolipáza) jsou enzymy třídy hydroláz, které katalyzují hydrolýzu fosfoglyceridů... Podle polohy hydrolyzované vazby ve fosfolipidu se rozlišují 4 hlavní třídy fosfolipáz: A, B, C a D.
/>
Lysofosfolipidy jsou štěpeny fosfolipázami L (existence polohově specifických fosfolipáz L1 a L2 nebyla prokázána). Fosfolipáza B je zastaralý název. léky s aktivitou typu fosfolipázy A a L.
/>
X - zbytek cholinu, serinu, myoinositolu atd.; pro fosfolipázy L1R2=C(0)R4, R3=H; pro fosfolipázy L2 R2=H, R3=C(O)R4
Každá z rodin fosfolipáz je heterogenní a zahrnuje enzymy, které se významně liší molekulovou hmotností, složením podjednotek a dalšími vlastnostmi. Všechny fosfolipázy nejaktivněji katalyzují hydrolýzu na rozhraní fosfolipid-voda; pomalu hydrolyzovat ve vodě rozpustné substráty.
Fosfolipáza AI - (EC 3.1.1.32, anglicky phospholipase A1) odštěpuje SN-1 acylový řetězec.
Fosfolipáza A2 - (EC 3.1.1.4, anglicky phospholipase A2) odštěpuje SN-2 acylový řetězec.
Fosfolipáza B-(lysofosfolipáza, anglicky fosfolipáza B) odštěpuje acylové řetězce SN-1 i SN-2. Fosfolipáza, která má aktivity jak fosfolipázy A1, tak A2, to znamená, že je schopná hydrolyzovat acylový řetězec fosfolipidu v polohách sn-1 a sn-2.
Fosfolipáza C - (EC 3.1.4.3, anglicky phospholipase C) hydrolyzuje vazbu mezi glycerolovou částí fosfolipidu a polární fosfátovou skupinou, což má za následek tvorbu diacylglycerolu a polární skupiny obsahující fosfát.
Fosfolipáza D - (EC 3.1.4.4, anglicky phospholipase D) hydrolyzuje vazbu mezi fosfátovou skupinou a alkoholovou skupinou, přičemž uvolňuje kyselinu fosfatidovou a alkohol. Existují 2 izoformy této fosfolipázy D1 a D2.
Fosfolipázy hrají důležitou roli v metabolismu lipidů v živých organismech. Používají se ke stanovení struktury fosfoglyceridů a umístění jejich lokalizace v membránách.

1. Fosfolipázy.
1.1 Klasifikace. Vlastnosti
Ve skutečnosti se rozlišuje několik fosfolipáz skupiny A, které jsou nedílnou součástí mnoha tkání a sekretů živých organismů.
Fosfolipázy A1 jsou většinou intracelulární enzymy, často vázané na membránu a nevyžadují koenzym. Jejich molekulové hmotnosti se pohybují mezi 15-90 tisíci; optimální katalytická aktivita nastává při pH 4,0 (pro lysozomální enzymy) nebo 8,0-9,5 (pro enzymy mikrosomů, plazmatických membrán a cytosolu); široce distribuován v živočišných tkáních (játra, srdce, mozek) a mikroorganismech (Bacillus subtilis, B. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli).
Fosfolipázy A1 odštěpují fosfolipidový acylový řetězec v poloze sn-1. Působením fosfolipázy AI na fosfolipid vzniká 1-lysofosfolipid a mastná kyselina. Fosfolipáza je aktivní složkou hadího jedu s hemolytickým účinkem.
Fosfolipázy A2 jsou nejvíce studovanými zástupci fosfolipáz. Jsou známy 3 skupiny fosfolipáz A2: 1) enzymy z jedů hadů, plazů a hmyzu, existující ve formě velkého množství izoforem; 2) enzymy slinivky břišní, produkované v těle ve formě zymogenů (prekurzory s vyšší molekulovou hmotností) a aktivované trypsinem; 3) intracelulární enzymy z krve a tkání zvířat, mezi nimiž jsou jak rozpustné, tak membránově vázané.
Fosfolipázy A2 prvních dvou podskupin jsou ve vodě rozpustné enzymy s molekulovou hmotností 11-19 tisíc (některé jsou aktivní ve formě dimerů), mají vysokou stabilitu díky velkému počtu (6-7) disulfidových vazeb. Optimální katalytická aktivita při pH 7,5-9,0; pl od 4,0 do 10,5; koenzym - Ca2+. U mnoha zástupců těchto podskupin fosfolipáz jsou známy primární a prostorové struktury. V aktivním centru byly nalezeny zbytky histidinu a kyseliny asparagové. Vlastnosti intracelulárních fosfolipáz A2 (třetí podskupina) závisí na subcelulární lokalizaci enzymu. Jejich molekulová hmotnost je 12-75 tisíc; optimální katalytická aktivita při pH 4,2-9,0 Některé enzymy této podskupiny neobsahují koenzymy.
Fosfolipázy B jsou izolovány z rostlin, mikroorganismů, včelího jedu a savčích tkání. Enzymy této skupiny jsou extrémně nespecifické, katalyzují hydrolýzu různých esterových vazeb a mají lytický (destruktivní) účinek ve vztahu k biologickým membránám (což určuje jejich toxicitu). Molekulová hmotnost fosfolipáz B je 15-65 tisíc, jsou méně stabilní než fosfolipázy A; jejich optimální katalytická aktivita nastává při pH od 4,5 (lyzozomální enzym) do 10,0 (jedovaté enzymy). Fosfolipázy nemají koenzymy a nejsou inhibovány kyselinou ethylendiamintetraoctovou. Některé fosfolipázy B jsou inhibovány diisopropylfluorfosfátem a kyselinou p-chlormercurbenzoovou. Univerzální inhibitory všech fosfolipáz B - surfaktanty.
Fosfolipáza B je schopna hydrolyzovat acylový řetězec fosfolipidu v poloze sn-1 a sn-2 Fosfolipáza zpravidla působí na lysolecitin (lysofosfatidylcholin), který vzniká působením fosfolipázy A1 nalecitin (fosfatidylcholin). ).
Fosfolipázy Nachází se v bakteriích Clostridium, Bacillus a Pseudomonas a také v buňkách savců (játra, mozek, slinivka břišní). Některé z nich se vyznačují přísnou specifitou s ohledem na alkoholovou skupinu molekuly substrátu, například cholinový zbytek (fosfolipáza Cx) a myoinositol (fosfolipáza C). Molekulová hmotnost fosfolipáz C je od 23 do 51 tis ionty jsou pro ně koenzymem a stabilizátorem. Optimální katalytická aktivita při pH asi 7 pro fosfolipázy Cx a při pH
Fosfolipáza C, která hydrolyzuje fosfodiesterovou vazbu mezi glycerolovým zbytkem fosfolipidu a polární fosfátovou skupinou, patří mezi fosfodiesterázy stejně jako fosfolipáza D. Fosfolipáza C je klíčovým enzymem v metabolismu fosfatidylinositolu a lipidových signálních drah.
Fosfolipáza C je aktivována podjednotkami Gαq nebo Gβγ G proteinu. Je tedy součástí receptoru spřaženého s G proteinem a odpovídající signální dráhy nebo součástí transmembránového receptoru s vlastní nebo přidruženou tyrosinkinázovou aktivitou.
Fosfolipáza C hydrolyzuje fosfatidylinositol (PIP2) na dva sekundární mediátory inositoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). Tyto mediátory se zapojují do následných fází signálních drah. Zejména modulují vápníkové kanály endoplazmatického retikula a proteinkinázu C, v daném pořadí.
Fosfolipáza D patří do skupiny důležitých enzymů, které plní různé funkce v živých systémech, od vstřebávání živin až po syntézu biologicky aktivních sloučenin. Nachází se v rostlinách (zelenina, řasy), mikroorganismech a živočišných tkáních. Jejich molekulová hmotnost je 90-116 tis. Optimální katalytická aktivita při pH 4,7-8,0. Kationtové povrchově aktivní látky inhibují fosfolipázy D, zatímco aniontové povrchově aktivní látky je aktivují.
Fosfolipáza D vykazuje primárně hydrolytickou aktivitu, která vede ke štěpení esterové vazby mezi zbytky kyseliny fosfatidové a alkoholem v molekulách fosfolipidu (PL). V tomto případě je druhý nahrazen vodíkem, ale zbytek kyseliny fosfatidové lze přenést na různé akceptory obsahující hydroxylové skupiny, což je velmi zajímavé pro biotechnologii, protože transfosfatidylační aktivita fosfolipázy může být využita pro syntézu různých drogy.
Fosfolipáza D specificky štěpí fosfatidylcholin na kyselinu fosfatidovou a cholin, přičemž cholin uvolňuje do cytoplazmy.
/>/>/>
fosfatidylcholin kyselina fosfatidová cholin
1.2 Fosfolipáza C - inositol-3-fosfátový systém
K aktivaci membránové guanylátcyklázy nedochází pod přímým vlivem komplexu hormon-receptor, ale nepřímo prostřednictvím ionizovaného vápníkového a oxidačního membránového systému. Ke stimulaci aktivity guanylátcyklázy, která určuje účinky acetylcholinu, dochází také nepřímo prostřednictvím Ca2+. Prostřednictvím aktivace guanylátcyklázy je realizován účinek síňového inatriuretického hormonu, atriopeptidu. Aktivací peroxidové oxidace stimuluje endoteliální hormon cévní stěny oxid dusnatý, relaxační endoteliální faktor, guanylátcyklázu. Pod vlivem guanylátcyklázy je z GTP syntetizován cGMP, který aktivuje cGMP-dependentní proteinkinázy, které snižují rychlost fosforylace lehkých řetězců myosinu v hladkých svalech cévních stěn, což vede k jejich relaxaci.
Ve většině tkání jsou biochemické a fyziologické účinky cAMP a cGMP opačné. Příklady zahrnují stimulaci srdečních kontrakcí pod vlivem cAMP a jejich inhibici cGMP, stimulaci kontrakce střevních hladkých svalů cGMP a inhibici cAMP. cGMP zajišťuje hyperpolarizaci retinálních receptorů pod vlivem světelných fotonů. Enzymatická hydrolýza cGMP a následně zastavení hormonálního účinku se provádí pomocí specifické fosfodiesterázy.
/>
Zprostředkování hormonálních signálů systémem fosfolipázy C-inositol-3-fosfátu.
Vznik komplexu hormon-receptor za účasti regulačního G proteinu aktivuje membránovou fosfolipázu C, která způsobí hydrolýzu membránových fosfolipidů za vzniku dvou sekundárních poslů: inositol-3-fosfátu a diacylglycerolu. Inositol-3-fosfát vede k uvolňování Ca2+ z intracelulárních zásob. Vazba ionizovaného vápníku na specializovaný protein, kalmodulin, aktivuje proteinkinázy a způsobuje fosforylaci intracelulárních strukturních proteinů a enzymů. Diacylglycerol zvyšuje afinitu proteinkinázy C k Ca2+, podporuje její aktivaci, která rovněž vrcholí procesy fosforylace proteinů. Diacylglycerol současně realizuje další způsob zprostředkování hormonálního účinku, aktivaci fosfolipázy A2 a tvorbu prostanoidů.
Hormonální receptorový komplex za účasti regulačního G proteinu vede k aktivaci membránového enzymu fosfolipázy C, která způsobí hydrolýzu membránových fosfolipidů za vzniku dvou druhých poslů: inositol-3-fosfátu a idiacylglycerolu. Inositol-3-fosfát způsobuje uvolňování Ca2+ z intracelulárních zásob, především z endoplazmatického retikula, ionizovaný vápník se váže na specializovaný protein kalmodulin, který zajišťuje aktivaci proteinkináz a fosforylaci intracelulárních strukturních proteinů a enzymů k prudkému zvýšení afinity proteinkinázy C k ionizovanému vápníku, ten se aktivuje bez účasti kalmodulinu, což také končí procesy fosforylace proteinů.
Diacylglycerol současně realizuje další způsob zprostředkování hormonálního účinku aktivací fosfolipázy A2. Vlivem posledně jmenovaného vzniká z membránových fosfolipidů kyselina arachidonová, která je zdrojem látek se silnými metabolickými a fyziologickými účinky - prostaglandinů a leukotrienů. V různých buňkách těla převládá jedna nebo druhá cesta pro tvorbu sekundárních poslů, což nakonec určuje fyziologický účinek hormonu. Prostřednictvím uvažovaného systému sekundárních poslů jsou realizovány účinky adrenalinu (ve spojení s alfa-adrenergním receptorem), vasopresinu (ve spojení s receptorem V-1), angiotensinu-I, somatostatinu a oxytocinu.

2. Fosfolipáza A2
2.1 Obecné informace (reakce, otevření, struktura)
Fosfolipáza A2 (E.F.3.1.1.4.) je enzym, který katalyzuje odštěpování zbytků mastných kyselin – lecitinu, kefalinu – z fosfolipidů a přeměňuje je na toxické sloučeniny, které výrazně snižují povrchové napětí. Tyto sloučeniny rozpouštějí červené krvinky a další buněčné a subcelulární struktury, a proto se nazývají lysolecitiny a lysokefaliny.
V molekule fosfolipidu fosfolipáza z včelího jedu odštěpuje mastnou kyselinu z druhého místa v molekule, a proto se nazývá fosfolipáza A2. Od roku 1897 je znám (Langer) jako faktor, který zvyšuje hemolytickou aktivitu včelího jedu po přidání lecitinu. Fosfolipáza je nejvíce studovaným enzymem ve včelím jedu. Fosfolipáza byla objevena jako trávicí enzym v roce 1900. Nyní je jasné, že fosfolipáza A2 (PLA2) je více než trávicí enzym. Je rozšířený a přítomný ve většině savčích buněk a tkání, slouží jako regulátor metabolismu, udržuje membránovou homeostázu a tvoří prekurzory eikosanoidů.
Podle molekulové hmotnosti, buněčné lokalizace a přítomnosti Ca2+ iontů se rozlišuje cytosolická PLA2, sekreční a na Ca-nezávislá PLA2 nebo vnější membránová PLA2.
PLA2 obsahují několik nepříbuzných proteinových rodin se společnou enzymatickou aktivitou. Dvě nejdůležitější rodiny jsou secernované cytosolové A2 fosfolipázy.
Cytosolická PLA2:
Intracelulární fosfolipázy, stejně jako extracelulární, jsou enzymy závislé na vápníku. Strukturálně se však jedná o velmi odlišné secernované fosfolipázy. Zpravidla jsou mnohem větší (více než 700 aminokyselin) a obsahují doménu C2, která směřuje enzym k buněčné membráně. Tyto fosfolipázy se účastní především buněčných signálních drah, jako je zánětlivá odpověď. Pod vlivem PLA2 se v buňce může tvořit kyselina arachidonová, prekurzor eikosanoidů, takové aktivní signální molekuly, jako jsou leukotrieny a prostaglandiny.
Vnější membrána PLA2:
Gramnegativní bakterie obsahují na své vnější membráně PLA2 s širokým rozsahem specificity. U Escherichia coli se tento enzym podílí na uvolňování bakteriocinového toxinu z buňky v důsledku zvýšené permeability membrány se zvýšením hladiny lysofosfolipidů a mastných kyselin v membráně.
Skrytá PLA2:
Extracelulární formy fosfolipáz byly izolovány z různých jedů hadů, včel a vos. Nacházejí se také ve všech tkáních savců a bakterií. Aktivita těchto fosfolipáz vyžaduje přítomnost vápníku.
/>
Fosfolipáza A2 z včelího jedu v extracelulárním prostoru poblíž lipidové dvojvrstvy. Polární skupiny fosfolipidů se nacházejí mezi žlutou a červenou rovinou. Nepolární acylové řetězce jsou mezi červenou a černou rovinou.
Pankreatická fosfolipáza je trávicí enzym a podílí se na trávení potravinových lipidů. Fosfolipázy z jedu se podílejí na imobilizaci oběti v důsledku lýzy jejích buněk.
2.2 Klasifikace a vlastnosti
2.2.1 Cytosolický PLA2
Historie cytosolových fosfolipáz skupiny A2 začala v roce 1991, kdy byl z cytosolu různých živočišných buněk izolován a klonován protein o molekulové hmotnosti 85 kDa, který se kromě molekulové hmotnosti lišil od tehdy známých fosfolipáz. čas v nepřítomnosti disulfidových můstků a citlivosti na vápník. Později screening nukleotidových bází umožnil najít další dva paralogy – cPLA2b a cPLA2g. První nalezený protein byl pojmenován cPLA2a. Tento enzym, nazývaný „cytosolický“, přesto působí na membrány cytoplazmatického retikula a jádra. Tato izoforma PLA2 je přítomna v mnoha buňkách a tkáních: mozek, ledviny, slezina, plíce, makrofágy, neutrofily, alveolární epiteliální buňky atd. Enzym se stává aktivním v důsledku fosforylace mitogenem aktivovanými proteinkinázami a proteinkinázou C. Aktivaci a syntézu cytosolické PLA2 indukují různé extracelulární cytokiny, mitogeny, hormony, neurotransmitery, faktory růstu, antigeny, endotoxiny a také některé fyzikální a stresové vlivy, včetně ultrafialového světla a oxidačního stresu.
Hlavním rysem tohoto izotypu enzymu je, že nejaktivněji hydrolyzuje fosfolipidové substráty obsahující kyselinu arachidonovou na druhé pozici. Tato substrátová selektivita určuje hlavní funkci enzymu v buňce.
Prostorová struktura tohoto enzymu byla charakterizována nukleární magnetickou rezonancí; Rentgenová strukturální data se objevila o něco později. Enzym hydrolyzuje esterovou vazbu v poloze sn-2. K dosažení maximální enzymatické aktivity jsou zapotřebí relativně nízké koncentrace Ca2+ iontů (asi 500 nmol/l); Přítomnost Ca2+ iontů je navíc nutná nikoli pro projev enzymatické aktivity, ale pro vazbu proteinu na povrch intracelulárních membrán nebo v případě modelových systémů na lipidové částice. Enzym prakticky nerozlišuje mezi skupinami v poloze sn-1, ale má specificitu pro fosfolipidy obsahující kyselinu arachidonovou v poloze sn-2. Kyselina olejová (18:1) a linolová (18:2) jsou slabě štěpeny z odpovídajících fosfolipidů pomocí cPLA2a, ale kyseliny a-linolová (18:3) a eikosapentaenová (20:5) mají výhody oproti kyselině arachidonové. Protože se tyto kyseliny nacházejí v buňkách v extrémně nízkých koncentracích, stávají se hlavním substrátem fosfolipidy s kyselinou arachidonovou v poloze sn-2. Enzym nevykazuje specificitu pro substituent v poloze sn-3, ale přesto není jeho substrátem diacylglycerol. Kromě hlavní aktivity vykazuje enzym také lysofosfolipázovou aktivitu, tj. je schopen odštěpovat acyl z polohy sn-1 lysofosfolipidu. Předpokládá se, že tato aktivita je nezbytná pro ochranu buňky před zvýšenou koncentrací lysofosfolipidů Bylo prokázáno, že enzym může také vykazovat aktivitu transacylázové aktivity. Biologický význam této aktivity je studován.
Paralogy cytosolického PLA2 byly popsány teprve nedávno a informace o jejich vlastnostech jsou omezené. Je známo, že protein cPLA2g neobsahuje doménu vázající vápník a je nezávislý na iontech Ca2+; má pouze 29% podobnost s aminokyselinovou sekvencí proteinu cPLA2a. Je vázán membránou přes palmitové místo a vykazuje hlavně izofosfolipázovou aktivitu. Byla prokázána jeho účast na rozvoji apoptózy makrofágů. Protein cPLA2b má doménu vázající vápník, ale také vykazuje převážně vlastnosti PLA1, tj. hydrolyzuje vazbu sn-1.
Enzym cPLA2a je v současné době jedinou fosfolipázou, která je specifická pro kyselinu arachidonovou a preferuje substráty lokalizované v membráně spíše než ty v monomerní formě v roztoku Možná lze tyto vlastnosti vysvětlit existencí amfifilního „víčka“ (aminokyselinové zbytky 413 -457), který zabraňuje vstupu zbytku mastné kyseliny fosfolipidu do aktivního středového tunelu, pokud protein není lokalizován na membránách. „Víko“ se otevře, když protein interaguje s membránovými lipidy. Mezifázová katalýza prováděná tímto enzymem byla intenzivně studována.
Objev cytosolické PLA2 na konci 80. let 20. století. dal podnět ke studiu regulace syntézy eikosanoidů v těle během akutní reakce na různé prozánětlivé podněty. Regulace sekreční fosfolipázy probíhá na úrovni její exprese a aktivita cytosolové fosfolipázy v buňce je také regulována na úrovni enzymové aktivity. Hlavními faktory ovlivňujícími aktivitu cytosolové fosfolipázy jsou koncentrace intracelulárního Ca2+ a fosforylace tohoto enzymu proteinkinázami. Koncentrace Ca2+ iontů a aktivita různých proteinkináz v buňce jsou velmi labilní parametry, které se po několika sekundách mění. vazba ligandů - agonistů s odpovídajícími buněčnými receptory, což umožňuje účinně regulovat produkci kyseliny arachidonové v buňce a tím i syntézu eikosanoidů.
V neaktivovaných buňkách se koncentrace intracelulárního Ca2+ obvykle pohybuje v rozmezí 30-100 nmol/l. Při aktivaci různých receptorů může koncentrace iontů Ca2+ dosáhnout 1-3 µmol/l. Řada studií prokázala, že ke zvýšení aktivity cytosolické PLA2 dochází v koncentračním rozmezí Ca2+ iontů 150-800 nmol/l. Se zvýšením koncentrace Ca2+ iontů migruje fosfolipáza k membránám a naváže se na ně, načež začíná hydrolýza fosfolipidů.
Vazba fosfolipázy na membránu nastává díky doméně C2 přítomné v proteinu:
/>
C2 doména je homologní s podobnými doménami proteinkinázy C, GTPázy a fosfolipázy C. Všechny tyto proteiny se vážou na membrány v přítomnosti Ca2+ iontů Přítomnost dostatečných koncentrací Ca2+ iontů je nezbytná pro orientaci fosfolipázy a její připojení . V nepřítomnosti Ca2+ iontů zůstává enzym aktivní vůči rozpustným substrátům, jako je 1-palmityl-2-lysofosfatidylcholin.
V závislosti na typu agonisty se různě mění koncentrace iontů Ca2+ v buňce. Někteří agonisté způsobují jeho krátkodobý intracelulární růst; vlivem těchto agonistů se koncentrace iontů Ca2+ po prudkém vzestupu během 1-2 minut vrátí na výchozí úroveň. Jiné způsobují prodloužené zvýšení koncentrace iontů Ca2+ a zvýšená koncentrace iontů Ca2+ zůstává v buňce 5-30 minut. Na epiteliálních buňkách bylo prokázáno, že pro stabilní připojení PLA2 na povrch biologických membrán je nutná zvýšená koncentrace Ca2+ iontů po dobu 5 minut a při krátkodobém vzestupu po 1-2 minutách reverzní disociace proteinu na cytosol probíhá bez znatelného uvolňování kyseliny arachidonové. Pokud zvýšená koncentrace Ca2+ iontů přetrvává 5 minut a déle, pak cytosolová fosfolipáza PLA2 zůstává na membráně a hydrolýza fosfolipidů pokračuje i poté, co se intracelulární koncentrace Ca2+ vrátí k normálním hodnotám.
Pro projev maximální aktivity fosfolipázy s krátkodobým zvýšením koncentrace iontů Ca2+ uvnitř buňky je nutná i fosforylace proteinu kinázami. Experimenty in vitro ukázaly, že cytosolová fosfolipáza může být fosforylována proteinkinázou C, mitogenem aktivovanými proteinkinázami p42/p44 nebo proteinkinázou A, ale pouze fosforylace mitogenem aktivovanými proteinkinázami (MAPK) vede k významnému zvýšení aktivity fosfolipázy . Mitogenem aktivované proteinkinázy fosforylují fosfolipázu na Ser-505. V některých případech je to fosforylace, která určuje projev fosfolipázové aktivity v buňce.
Cytosolová fosfolipáza se tedy podílí jak na regulaci syntézy eikosanoidů při akutní buněčné odpovědi na různé prozánětlivé podněty, tak v některých případech při opožděné odpovědi. Hlavními faktory regulujícími aktivitu cytosolové fosfolipázy jsou koncentrace intracelulárního Ca2+ a aktivita mitogenem aktivovaných proteinkináz. Aktivita enzymu se může výrazně zvýšit během prvních minut po stimulaci buněk. Translokace enzymu po aktivaci je důležitá ze dvou důvodů: 1) umožňuje enzymu interagovat s fosfolipidy membrány; 2) dodává lipázu selektivní pro kyselinu arachidonovou do místa enzymů pro syntézu prostaglandinů (PG) a leukotrienů (LT), tj. potenciálně je možná tvorba kompartmentu, ve kterém je uvolněná kyselina arachidonová přímo dále metabolizována.
2.2.1 Sekreční PLA2
Sekreční PLA2 mají molekulovou hmotnost cca 14 kDa, vyznačují se absolutní potřebou Ca2+ iontů v milimolárních koncentracích pro katalytickou aktivitu, pH optimum je v rozmezí 7-9.
V současné době je popsáno deset typů sekreční PLA2 (IB, IIA, IIC, IID, IIE, IIF, III, V, X, XII), které se liší primární strukturou a umístěním disulfidových můstků. Všechny typy sekrečních fosfolipáz jsou globulární proteiny bohaté na cystein (5-8 disulfidových můstků), který zajišťuje stabilitu enzymu včetně odolnosti vůči proteolýze a denaturaci. Enzym nevykazuje selektivitu pro složení mastných kyselin fosfolipidů, ale přednostně hydrolyzuje negativně nabité fosfolipidy (kyselinu fosfatidovou a fosfatidylglycerol).
Dlouhou dobu byl znám pouze jeden PLA2, který je hojně přítomen v pankreatické tekutině (typ IB). V roce 1989 byla objevena a naklonována fosfolipáza typu IIA, která je uložena v sekrečních granulích krevních destiček a jejíž koncentrace se významně zvyšuje v místech zánětu, jako je synoviální tekutina revmatoidní artritidy. Tyto proteiny jsou velmi podobné proteinům hadího jedu. Mezi proteiny včelího a ještěrčího jedu byly objeveny další fosfolipázy, které jsou klasifikovány jako typ III. U savců byl protein odpovídající tomuto typu objeven až v roce 2000... Nové období ve výzkumu sekrečních fosfolipáz začalo v roce 1994, kdy byly objeveny proteiny typu IIC a V Tento objev vedl k revizi role této rodiny proteinů v regulaci buněčných funkcí a intenzivní hledání nových podobných proteinů . Byly objeveny proteiny typů X, IID, IIE a IIF, XII.
Všechny tyto proteiny (kromě proteinu typu III) mají molekulovou hmotnost 14-17 kDa, obsahují histidin v katalytickém místě a vykazují fosfolipázovou aktivitu v přítomnosti milimolárních koncentrací vápníku. Mají vysoce konzervované aminokyselinové sekvence v katalytické oblasti (DXCCXXHD) a oblasti smyčky vázající vápník (XCGXGG), stejně jako 6-8 konzervovaných sulfidových můstků. Aktivní centrum obsahuje také aspartát, který spolu se smyčkou vázající vápník působí jako kapsa pro iont Ca2+.
Enzymy této rodiny nevykazují žádnou specificitu ani pro skupinu spojenou se zbytkem kyseliny fosfatidové, ani pro katalovou skupinu v poloze sn-2. Přítomnost oxidovaných forem mastných kyselin ve fosfolipidech zvyšuje aktivitu sekrečních fosfolipáz, což naznačuje jejich účast na regulaci membránové viskozity během oxidačního stresu. Z rentgenové strukturní analýzy prvních dvou skupin proteinů vyplývá, že existuje hydrofobní kanál, do kterého vstupuje molekula fosfolipidu po mezifázové vazbě proteinu na fosfolipidový povrch.
Sekreční PLA2 je konstitutivně obsažena v různých buňkách zapojených do vývoje imunitních a zánětlivých reakcí: makrofágy, žírné buňky, fibroblasty a tkáně orgánů, jako jsou játra, slezina, brzlík, kostní dřeň a střeva. Aktivita enzymu na buněčné úrovni je regulována díky jeho indukci různými zánětlivými podněty (interleukin-1 a interleukin-6, tumor nekrotizující faktor, lipopolysacharid, interferon-g, forbolestery, nervový růstový faktor). V souladu s indukcí různými stimulanty obsahuje promotor genu IIA nukleotidové sekvence TATA a CAAT, stejně jako vazebné sekvence pro transkripční faktory, jako jsou AP-1, C/EBP, CREB, NF-kB, STAT, PPA Rg. U některých buněk závisí exprese PLA2 na předběžné aktivaci cytosolové fosfolipázy PLA2a a předpokládá se zapojení produktů 12/15-lipoxygenázové dráhy do procesu regulace fosfolipázy IIA. Glukokortikoidy (steroidní protizánětlivé léky) jsou supresory exprese fosfolipázy IIA.
Změny v expresi fosfolipázy IIA jsou v mnoha případech spojeny s modulací prostaglandinové větve kaskády kyseliny arachidonové. Stimulace interleukinem-1 a tumor nekrotizujícím faktorem tedy aktivovala jak syntézu sekrece fosfolipázy, tak syntézu prostaglandinu E2 a prostacyklinu v mezangiálních, respektive endoteliálních buňkách. Když byly k buňkám přidány protilátky proti fosfolipáze, syntéza prostacyklinu byla částečně potlačena. Z výsledků získaných v posledních letech vyplývá, že sekreční fosfolipázy (IIA a podobné V, X) se podílejí na procesech rychlé i opožděné produkce kyseliny arachidonové a prostanoidů.
Je třeba poznamenat, že přidání sekrečních fosfolipáz do extracelulárního prostředí vede k aktivnímu uvolňování kyseliny arachidonové a syntéze prostanoidů aktivovanými buňkami, ale nemá prakticky žádný vliv na hydrolýzu membránových fosfolipidů klidových buněk.
Kromě úlohy enzymu zodpovědného za přítomnost kyseliny arachidonové mohou sekreční fosfolipázy působit jako fyziologicky aktivní látky. V žírných buňkách tedy specifické inhibitory sekrečních fosfolipáz snižovaly expresi cyklooxygenázy-2 stimulovanou nervovým růstovým faktorem. Současně byly katalyticky neaktivní mutanty proteinu fosfolipázy schopny vyvolat i expresi cyklooxygenázy-2, tzn. tento účinek nezávisí na enzymatických vlastnostech fosfolipázy. Mechanismus tohoto procesu není jasný. Mohou být zahrnuty funkce sekreční PLA2 jako ligandu specifických receptorů.
V roce 1995 se totiž ukázalo, že existují specifické proteiny, které se vážou na fosfolipázu typu IB (disociační konstanta výsledného komplexu je 1 nmol/l) a vykazují různé biologické účinky. Během následujících 10 let bylo objeveno mnohem více proteinů, rozpustných a vázaných na membránu, které jsou schopné vázat sekreční fosfolipázu. Pouze jeden z těchto proteinů však vykazuje vlastnosti „klasického“ receptoru, který po navázání ligandu aktivuje intracelulární systém přenosu signálu. Je to protein typu M nebo sPLA2R. Gen pro tento protein je lokalizován na druhém chromozomu; proteinová sekvence má 75% homologii mezi řadou druhů savců; gen má 1 kopii a není v žádném případě podobný jiným genům. Protein má molekulovou hmotnost 180-200 kDa, jeho významná část se nachází v extracelulární oblasti a sekvence 40 aminokyselinových zbytků se nachází v cytosolu. Protein bez této cytosolové oblasti se vyskytuje v rozpustné formě a jeho role je ukázána jako inhibitor účinků sekrečních fosfolipáz. U lidí je protein exprimován ve slinivce břišní, plicích a kyčlích. Byla prokázána významná role aktivace tohoto receptoru při rozvoji endotoxického šoku.
Obrázek ukazuje schéma účasti sekrečního fosfolipázového receptoru na realizaci biologické role enzymu na buněčné úrovni.
/>
Diagram ukazuje, jak aktivní formy fosfolipázy sPLA2-IB nebo sPLA2-X vykazují svou enzymatickou aktivitu, která vede ke vzniku lipidových mediátorů, a jsou také vysoce afinitními ligandy pro receptor lokalizovaný v plazmatické membráně. Interakce fosfolipázy s membránovým receptorem vede k indukci mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPK) a odpovídající intracelulární signální dráhy, která stimuluje různé buněčné reakce: buněčnou proliferaci a migraci, syntézu fyziologicky aktivních látek. Při ztrátě kontaktu s membránou si receptor zachovává schopnost vázat fosfolipázu, což umožňuje regulovat aktivitu fosfolipázy jako enzymu a jako ligandu.
Sekreční fosfolipázy se tedy významně podílejí na vzniku a šíření zánětlivých procesů v organismu. Exprese sekrečních fosfolipáz se významně zvyšuje u různých zánětlivých onemocnění. Z tohoto důvodu jsou vyvíjeny selektivní inhibitory enzymatické aktivity proteinů této rodiny jako potenciální nová třída protizánětlivých látek. Pro hledání inhibitorů sekrečních fosfolipáz je slibné využití metod počítačového modelování, protože tyto nízkomolekulární proteiny (jejich molekulová hmotnost je asi 14 kDa) byly získány v krystalickém stavu a jsou známy jejich trojrozměrné struktury. Existuje důvod se domnívat, že v příštích 5-10 letech budou na základě výsledků těchto studií vytvořeny nové terapeutické technologie a nové léky.
2.2.3 Na vápníku nezávislý PLA2
Klasická na vápníku nezávislá PLA2 (iPLA2-VIA) existuje ve voligomerní formě a má několik sestřihových variant, z nichž alespoň dvě (VIA-1 a VIA-2) mají enzymatickou aktivitu. Protein iPLA2-VIA-1 má molekulovou hmotnost 85 kDa; obsahuje 8 ankyrinových repetic v N-terminální oblasti, katalytickou doménu s charakteristickou aminokyselinovou sekvencí GXSXG, kde S - serin-465 působí jako centrum katalýzy. Existuje také ATP-vazebná sekvence GXGXXG. V blízkosti C-konce (v oblasti aminokyselinových zbytků 694-705) se nachází vazebná oblast pro kalmodulin. Tvorba komplexu proteinu iPLA2-VIA s aktivovaným kalmodulinem (tj. v přítomnosti Ca2+ iontů) vede k inaktivaci této fosfolipázy. Ačkoli obě sestřihové formy VIA-1 a VIA-2 mají sekvence vázající ATP, bylo prokázáno, že pouze iPLA2-VIA-2, ale ne iPLA2-VIA-1, se v přítomnosti ATP aktivuje několikrát.
Ankyrinové repetice se nacházejí v několika stovkách proteinů, jako jsou transkripční faktory a regulátory buněčného cyklu. Předpokládá se, že tento motiv je zapojen do interakcí protein-protein. Předpokládá se, že protein iPLA2-VIA je v buňkách přítomen jako tetramer a pravděpodobně se na oligomerizaci proteinu podílejí ankyrinové motivy. Fosfolipáza iPLA2-VIA není specifická pro povahu mastné kyseliny v poloze sn-2 a substituentu v poloze sn-3 fosfolipidu; Je plně aktivní v nepřítomnosti vápníku a provádí katalýzu fázového přenosu. Enzym také vykazuje lysofosfolipázovou aktivitu v poloze sn-1, transacylázovou aktivitu a aktivitu charakteristickou pro protein PAF-AH.
Protein iPLA2-VIB obsahuje motiv lipázy GVSTG, kde serin-483 je umístěn v katalytickém centru; motiv vázající ATP; motiv lokalizace signálu v peroxisomech na C-konci molekuly. C-konce molekul, včetně ATP-vazebné repetice a katalytické oblasti, iPLA2-VIB a iPLA2-VIA proteinů jsou podobné. Rozdíly jsou pozorovány na N-konci proteinu, kde protein iPLA2-VIB má netankyrinové motivy, mnoho serinových a threoninových zbytků, z nichž některé mohou být fosforylovány proteinkinázami A a C. Existuje také pět Ser-Pro oblasti, které jsou cíli pro prolinkinázy. Jedna z těchto sekvencí (PTSP, zbytky 269-272) je místem fosforylace mitogenem aktivovanými proteinkinázami. Aktivita této izoformy nezávisí na vápníkových iontech. Přítomnost různých fosforylačních míst v proteinech skupiny iPLA2-VI ukazuje, že role proteinů iPLA2-VIA a iPLA2-VIB v buňkách se mohou lišit. Obě na vápníku nezávislé fosfolipázy (iPLA2-VIA a iPLA2-VIB) jsou membránově vázané proteiny.
2.3 Specifičnost substrátu
Katalýza působením PLA2 je charakterizována povrchovou, polohovou a sterickou specifitou enzymu. Fosfolipáza katalyzuje reakci na rozhraní lipid/voda. Na jedné straně u většiny lipolytických enzymů, včetně PLA2, je aktivita enzymu výrazně vyšší, když substráty existují ve formě agregátů (micely, smíšené micely, monovrstvy a dvojvrstvy), než když působí na substráty rozpustné ve vodě v monomolekulární formě.
Na druhou stranu PLA2 nepůsobí na lipidové molekuly v hustě zabalených, a tudíž těžko dostupných lipidových agregátech. K vytvoření fázového rozhraní se v těchto případech obvykle používají detergenty (Triton x-100, deoxycholát sodný). Bylo prokázáno, že pro optimální projev povrchové specifičnosti enzymu je nezbytná přítomnost agregovaných substrátů s určitou délkou acylového řetězce.
S objevem sterické a polohové specifičnosti PLA2 byly formulovány spíše přísné minimální požadavky enzymu na substrát: v poloze sn-2 glycerolového zbytku musí lipid obsahovat esterovou skupinu a v poloze sn-3 pozice - fosfátová skupina. Později se ukázalo, že zbytek kyseliny fosforečné lze nahradit kyselinou sulfoniovou: sulfolipid se ukázal jako dobrý substrát PLA2, odpovídající fosfolipidy, kde je vazba C-O-P nahrazena vazbou C-P, jsou také hydrolyzovány enzymem, ale v menší míře. Minimální požadavky enzymu na substrát jsou proto v současné době redukovány na skutečnost, že glycerofosfolipid má přirozenou L-konfiguraci a má esterovou vazbu v poloze sn-2 glycerolu a také obsahuje skupinu se silnými aniontovými vlastnostmi při vzdálenost pěti až šesti atomů od karboxylového uhlíku. Předpokládá se, že fosfátová skupina musí mít jednu volnou kyselou funkci.
Ve fosfolipidu se dvěma citlivými esterovými vazbami - difosfatidylglycerolem (kardiolipiny) - mohou být obě hydrolyzovány. Bylo zjištěno, že β-lecitiny (1,3-diacyl-sn-glptsero-2-fosfocholin) jsou hydrolyzovány PLA2 z hadího hada Crotalusadaincniteus, ačkoliv relativně nízkou rychlostí PLA2 nehydrolyzuje amidovou vazbu sfingolipidů. Thiolové analogy fosfatidylcholinů jsou dobrými substráty, což umožňuje sledovat proces hydrolýzy spektrofotometricky. De Haas et al. zjistili, že negativní náboj na fosfátové skupině není pro substrát absolutním požadavkem.
Díky své stérické a polohové specifičnosti je PLA2 cenným nástrojem v chemii lipidů a biochemii. Používají se ke stanovení poziční distribuce mastných kyselin při analýze fosfoglyceridů, k separaci racemických směsí lipidů a také při syntéze lipidů k ​​získání fosfoglyceridů se směsným složením mastných kyselin.
Substrátová specifičnost buněčného PLA2 není dosud plně objasněna, nicméně byly shromážděny údaje o struktuře substrátů pro buňky PLA2 v krvi a imunitním systému, zejména specifita těchto enzymů pro fosfatidylcholiny obsahující arachidonát v sn-; Byla prokázána poloha 2 glycerolu.
2.4 Inhibitory PLA2
2.4.1 Nekompetitivní inhibitory
Snížení katalytické aktivity PLA2 může nastat v důsledku nerovnováhy v jednom nebo několika stupních enzymatické reakce, proto lze známé inhibitory tohoto enzymu zhruba rozdělit následovně.
a) Vazba enzymovým inhibitorem (E) může posunout E↔E* rovnováhu doleva a snížit koncentraci katalyticky aktivního E*. K tomu dochází, když jsou substrátové vezikuly doplněny o vezikuly nehydrolyzovatelného analogu substrátu, na který se enzym váže, ale nemůže být rychle desorbován. Potřeba přítomnosti vápenatých iontů během vazby PLA2 na mezifázový povrch dává důvod klasifikovat chelatační činidla, jako je EDTA, jako inhibitory.
b) Lipofilní sloučeniny mění fázové vlastnosti substrátů a snižují hustotu náboje na mezifázovém povrchu, čímž posouvají E↔E* rovnováhu doleva. Ukázalo se, že takové změny způsobují organická rozpouštědla, detergenty, alkoholy, ale i kationtové amfifily, fenothiaziny a lokální anestetika různé chemické povahy. Další inhibitory – mastné kyseliny, mepakrin, kyselina aristolochová – rovněž ovlivňují vazebně-desorpční stadium E↔E*, aniž by ovlivnily katalytický účinek enzymu na mezifázový povrch.
c) Některé typy nespecifické inhibice. Za určitých podmínek se výrazně zvyšuje rychlost hydrolýzy pod vlivem PLA2 fosfolipidů, které prošly peroxidací. Proto se má za to, že antioxidanty mají potenciál snižovat aktivitu enzymů. Proteiny, jako je lipokortin a kalpactin, solubilizují fosfolipidy mezifázového povrchu, čímž snižují aktivitu PLA2. Anionty rozpustné ve vodě, jako je heparin, inhibují vazbu PLA2 na rozhraní blokováním aniontového vazebného místa enzymu.
d) Kovalentní modifikace aminokyselinových zbytků PLA2. 1-bromoctan-2-on a n-bromfenacylbromid se kovalentně váží na His-48 v katalytickém centru enzymu a zcela inhibují katalytickou aktivitu; rychlost takové modifikace je významně snížena, když je enzym již navázán na mezifázový povrch. Dialdehydy jako gossypol modifikují aminoskupiny PLA2 lysinových zbytků odpovědných za jeho mezifázovou vazbu. rychlost modifikace se zvyšuje v případě enzymu již spojeného s povrchem rozhraní Nesteroidní terpenoidní manoalid, izolovaný z mořské houby, a jeho syntetický analogový manoalog působí podobným způsobem.
e) Další spojení. Je pravděpodobné, že mnoho dalších sloučenin, včetně některých léků, inhibuje aktivitu PLA2 in vivo, avšak mechanismus jejich inhibičního působení nebyl dosud objasněn. Mezi tyto látky patří bioflavonoidy a retinoidy, hydroxyeikosatetraenové kyseliny, fenofetol (agonista β-adrenergních receptorů), gabexát mesylát, nisergolin, papaverin, cinnarizin a amperon.

2.4.2 Konkurenční inhibitory
Kompetitivní inhibitory PLA2 jsou analogy substrátů, reakčních produktů nebo komplexů přechodného stavu. Soutěží se substrátem o vazbu na aktivní centrum molekuly E*, čímž účinně snižují koncentraci komplexu ES*. Tento mechanismus inhibice byl experimentálně potvrzen při studiu katalýzy fosfolipidů pod vlivem PLA2 podle typu „scooting“.
Běžnou strategií pro vytváření inhibitorů je nahrazení PLA2-senzitivní esterové vazby nehydrolyzovatelnou skupinou. V tomto případě musí inhibitor zůstat blízkým strukturním analogem substrátu a nesmí způsobovat změny v lipidových membránách. V tuto chvíli není možné porovnat dostupné údaje o kompetitivních inhibitorech, protože dosud nebyla vyvinuta jednotná teorie a kvantitativní popis lipolýzy na rozhraní lipid/voda.
Aminoacylfosfolipidy. Mezi fosfatidylcholiny s modifikací sn-2-esterové vazby byla objevena třída silných kompetitivních inhibitorů PLA2 - analogy sn-2-amidu. Nahrazení sn-2-esterové vazby etherovou vazbou nebo uhlovodíkovým zbytkem také vedlo ke kompetitivní inhibici PLA2, ale v menší míře.
Vliv aminoacylových analogů fosfolipidů na enzymatickou aktivitu PLA2 byl studován především v modelových experimentech se smíšenými micelami za následujících podmínek:
1) celková koncentrace lipidů (inhibitoru a substrátu) [I] + [S] musí být konstantní pro výpočet molární frakce inhibitoru, α = [I]/([I] + [S]);
2) molekuly substrátu a inhibitoru musí zaujímat stejnou oblast na povrchu rozhraní;
3) mezifázový povrch micel musí být dostatečně velký, aby byl enzym pouze ve vázané formě.
Pro posouzení vlivu inhibitoru na aktivitu PLA2 byla použita podmíněná hodnota inhibiční síly (Z), která je mírou poměru mezifázových disociačních konstant pro substrát a inhibitor a je určena výrazem :

Rv= I + αZ,
kde Rv je poměr reakční rychlosti při K≠Km k reakční rychlosti při Ki=Km, a je molární zlomek inhibitoru v micele.
Byl také studován inhibiční účinek (R)-1-alkyl-2-acylamino-1,2-dideoxyglycero-3-fosfocholinových analogů na savčí pankreatické fosfolipázy. Mezi inhibitory nasycenými řetězci mastných kyselin měly největší aktivitu analogy s C10 acylovými řetězci. Chování nenasycených analogů bylo složitější jak u zwitteriontových, tak u aniontových inhibitorů, zvýšení počtu cis-dvojných vazeb na jejich specifickém místě na vacylovém řetězci vedlo ke zvýšení parametru Z.
V průběhu studií s thioamidovými analogy substrátů se ukázalo, že thioamidový analog fosfatidylethanolaminu s lC50 = 4,5 * 10-7 M je nejsilnější známý inhibitor PLA2.
Studie provedené s aminoacylovými inhibitory odhalily několik aspektů interakce enzym/lipid:
1) Zavedení amidového zbytku do polohy sn-2 fosfolipidu výrazně zvyšuje jeho vazbu na katalytické centrum PLA2: nukleofilnější kyslík amidové skupiny je schopen silněji interagovat s elektrofilem tohoto centra (pravděpodobně Ca2+). Amidová skupina také poskytuje lepší příležitosti pro vodíkové vazby.
2) α-methylenová skupina acylového zbytku v poloze sn-2 fosfolipidu je zodpovědná za vazbu fosfolipidu na katalytické centrum enzymu.
3) Zvýšení hydrofobnosti funkční skupiny v poloze sn-1 fosfolipidu zvyšuje afinitu mezi enzymem a substrátem.
4) Ukázalo se, že fosfatidylethanolaminy jsou silnějšími inhibitory než fosfatidylcholiny.
Přístup k syntéze opticky aktivních 1-acyl-2-acylamino-2-deoxyglycerofosfocholinů je založen na zachování chirality výchozí sloučeniny (L-serinu) během syntézy. Zvolená sekvence zavádění substituentů zahrnuje použití minimální počet chránících skupin. Byla také vyvinuta stereospecifická metoda syntézy 1-alkyl-2-acylamino-2-deoxyglycerofosfocholinů z L-serinu. Zavedení alifatické alkylové skupiny se provádí interakcí methansulfonátu mastné kyseliny s oxazolinem chráněným deoxyglyceridem. Bylo navrženo, aby byly racemické acylaminoanalogy fosfolipidů s dlouhým řetězcem získány z 2-aminopropanolu. Je popsána syntéza opticky aktivního thioamidového analogu fosfatidylcholinu.
Analogy ftarketonu. Již dříve bylo zjištěno, že substrátové analogy obsahující polarizované ketonové skupiny, včetně fluoroketonových a 1,2-diketonových skupin, inhibují hydrolytické enzymy. Nejlepším inhibitorem byl substituovaný fosfoethanolamin s jedním acylovým zbytkem, a to navzdory skutečnosti, že enzym preferuje substráty se dvěma acylovými zbytky.
Protože se difluorketonová skupina snadno hydratuje ve vodném roztoku, inhibitory svou strukturou připomínají tetraedrický meziprodukt, který se tvoří během lipolýzy.
Mezi fluoroketonovými analogy byly nalezeny selektivní inhibitory intracelulárního cytosolického PLA2. Ukázalo se, že tyto inhibitory jsou elektrofilní ketonové analogy kyseliny arachidonové.
Nejúčinnějším inhibitorem byl α-trifluormethylketon kyseliny arachidonové. Struktura komplexu této látky s PLA2 byla analyzována pomocí 19F a 13C NMR spektroskopie. Výsledky potvrdily hypotézu, že vazba na aktivní centrum enzymu tvoří hemiketal se serinovým nebo threoninovým zbytkem molekuly proteinu díky schopnosti α-fluorketonů snadno hydratovat ve vodných roztocích.
Fosfátové analogy. Pro studium povahy inhibice PLA2 z různých zdrojů a vlivu substituentů na inhibiční schopnost bylo syntetizováno více než 100 sn-2-fosfátových analogů fosfatidylcholinů. Sloučeniny této třídy inhibovaly pouze enzym již spojený s povrchem rozhraní a neměly žádný vliv na desorpci enzymu. Fosfátové inhibitory se vážou na aktivní centrum enzymu přes iont vápníku přes koordinační vazbu E-Ca... O=P, soutěží se substráty. Tato interakce je modulována substituenty na molekule inhibitoru. Nahrazení atomu O v tomto komplexu S, NH2, O=P skupiny O=C-O a přítomnost záporně nabité fosfátové skupiny významně snížily afinitu k enzymu. Inhibiční schopnost fosfoesterů byla přísně závislá na stereochemických a strukturních vlastnostech: chiralita polohy sn-2, délka alkylového řetězce v poloze sn a přítomnost hydrofobního substituentu v poloze sn-3 glycerolu. . Analogy dianiontových fosfomonoesterů nevykazovaly inhibiční vlastnosti, sulfonát, amid, oxim.
Alkylfosfotidylcholiny. Pro farmakologické použití jsou zřejmě nejslibnější látky, které mohou inhibovat PLA2, aniž by narušily strukturní organizaci membrány. V tomto ohledu jsou zvláště zajímavé lipidy s etherovými vazbami. V lipidových molekulách této třídy jsou hydrofobní substituenty připojeny k hydrofilnímu zbytku prostřednictvím nehydrolyzovatelné etherové vazby PLA2. Zároveň se membránové lipidy s etherovou vazbou ve svém složení prakticky neliší od svých diacylových analogů. Studovali jsme vliv éterově vázaných fosfatidylcholinů s dlouhým řetězcem na destrukci membrán pod vlivem PLA2 pomocí P-NMR spektroskopie a hodnotili jsme možnost využití lipidů při lokálních zánětlivých reakcích.
Pro studované inhibitory byly získány téměř identické výsledky: zavedení sloučenin do lipidové dvojvrstvy z vaječného fosfatidylcholinu v molárním poměru 1:1 vedlo k tak účinné stabilizaci membrány, že nebyly pozorovány žádné strukturální přestavby pod vlivem tohoto enzymu.
Mezi fosfolipidy této třídy byly nalezeny inhibitory cytosolického PLA2, které mají protizánětlivé a antialergické vlastnosti.

2.5 Význam pro organismus při zhoršené činnosti
Nadměrná aktivace PLA2 je důležitá v patogenezi poškození buněk. Nenasycené mastné kyseliny (arachidonová, pentanová aj.) uvolněné působením fosfolipázy se spotřebovávají za vzniku fyziologicky aktivních sloučenin - prostaglandinů a leukotrienů. Zbývající část molekuly fosfolipidu (lysofosfolipid) má pouze jeden „ocásek“ mastné kyseliny, díky čemuž má schopnost tvořit micely a je velmi silným detergentem. Poškození buněčných membrán za podmínek nadměrné aktivace PLA2 je spojeno s detergentním účinkem lysofosfolipidů.
Farmakologické a toxické vlastnosti fosfolipázy díky její biochemické aktivitě. S pomocí svého toxického lysolecitinu rozkládá krevní a tkáňové struktury, poškozuje jejich buněčné membrány a organely. Fosfolipáza snižuje srážlivost krve ničením složek podporujících srážlivost, které obsahují fosfolipidy. Poškozuje mitochondriální membrány, které jsou důležitou buněčnou organelou, nositeli komplexních enzymových systémů. Účastní se metabolismu a redoxních procesů. Poškození fosfolipidové struktury nervových vláken je pravděpodobně způsobeno fosfolipázou, která blokuje vedení mezi nervovou a svalovou tkání.
Zavedení fosfolipázy pod kůži způsobuje lokální záněty, nitrožilní podání je doprovázeno poklesem krevního tlaku u pokusných zvířat, plicním edémem a krvácením do alveol. U zvířat, která přežila několik hodin, je v moči detekován hemoglobin ze zničených červených krvinek. Navíc bylo zjištěno, že fosfolipáza z včelího jedu, podávaná subkutánně, podporuje rozvoj modelových zánětlivých procesů různé etiologie.
Bylo navrženo, že melittin svým účinkem na snížení povrchového napětí připravuje fosfolipidy pro enzymatickou aktivitu fosfolipázy. Ze všech složek včelího jedu je fosfolipáza nejsilnější antigenní a alergenní dráždidlo. Krev včelařů imunních vůči včelímu jedu obsahuje protilátky s vysokým titrem proti jedu. Pacienti přecitlivělí na včelí jed vykazovali při laboratorních testech na alergii akutní reakci na fosfolipázu.
Toxické a alergické vlastnosti fosfolipázy, které zesilují zánětlivé procesy, ji charakterizují jako složku včelího jedu, která je škodlivá pro lidské tělo.
Aktivace PLA2 je závislá na vápníku. Dochází k němu při stimulaci buněk nadledvin, což vede k urychlení přeměny arachidonylfosfatidylinositolu. Tento účinek je rovněž způsoben kalciovým ionoforem a může odrážet zvýšení intracelulárních hladin vápníku a sekundární stimulaci PLA2 jako časnou reakci doprovázející interakci s receptorem. Je známo, že účinek nasteroidogeneze v nadledvinách závisí na vápníku, nikoli pouze na tvorbě cAMP. Alespoň část potřeby vápníku může souviset s přeměnou membránových fosfolipidů zprostředkovanou PLA2 během aktivace kůry nadledvin.
Mechanismus včetně aktivace fosfolipázy může odrážet obecnou vlastnost hormonálně regulovaných sekrečních buněk s hormonální stimulací specifických cílových buněk, mění se tedy i další fáze metabolismu fosfolipidů, kde LH zvyšuje produkci prostaglandinů hormon nezvyšuje tvorbu kyseliny arachidonové, ale působí v pozdějších stádiích a zvyšuje aktivitu prostaglandinsyntetázy. Zdá se, že tento účinek LH na syntézu prostaglandinů v Graafově folikulu (vezikulární ovariální folikul) nezprostředkovává steroidogenní účinky gonadotropinu, ale hraje důležitou roli ve vývoji ovulace.
2.6 Využití PLA2 v medicíně
Sekreční PLA2 je považován za jeden z patogenetických faktorů při vzniku řady onemocnění: revmatoidní artritida, ateroskleróza. V posledních letech se objevily informace o zapojení tohoto enzymu do plicní patologie. Zvláště zajímavý je patogenetický řetězec „sPLA2 – syndrom akutní respirační tísně (ARDS) – plicní surfaktant“.
Syndrom akutní dechové tísně u dospělých vzniká jak přímým působením na plíce (aspirace, inhalace toxických látek, 100% kyslík, nedostatečně kvalifikovaná mechanická ventilace), tak nepřímými vlivy (sepse, šok jakékoliv etiologie, polytrauma, krevní ztráty) . Přes roky intenzivního výzkumu zůstává mechanismus rozvoje ARDS nejasný a jeho úmrtnost je vysoká (~50 %). Předpokládá se, že původem tohoto stavu plic je snížení produkce a aktivity povrchově aktivní látky.
Plicní surfaktant je lipoglykoproteinový komplex, který je syntetizován alveolocyty typu II. Skládá se z 80-90% fosfolipidů, 5-10% neutrálních lipidů a 5-10% proteinů. Kromě povrchově aktivních vlastností nezbytných pro normální dýchání má protizánětlivé a imunoregulační účinky. Porušení její celistvosti vede ke zvýšení povrchového napětí nejen v alveolech, ale také v bronchiolech a malých průduškách.
Substrátová specifičnost cytosolové PLA2 k substrátům obsahujícím arachidonoyl naznačuje, že tato izoforma hraje hlavní roli v patogenezi astmatu. Je známo, že leukotrieny B4, C4, D4, E4 jsou hlavní skupinou mediátorů zapojených do komplexního zánětlivého procesu a vedoucích ke klinickým projevům astmatu. Působením leukotrienů je stahování hladkého svalstva průdušek, zvýšení množství produkovaného hlenu, stimulace vaskulární permeability a tvorba otoků. Všechny tyto příznaky jsou charakteristické pro astma. Leukotrieny jsou syntetizovány v reakci na expozici alergenu nebo nespecifickou reakci vedoucí k aktivaci cPLA2.
Chilton F.H. studoval přítomnost produktů aktivity fosfolipázy v tekutině bronchoalveolární laváže pacientů s astmatem 5-30 minut, 6, 20 hodin po expozici antigenu. Koncentrace lysoproduktů byla 7x vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou. Bylo tedy navrženo, že hydrolýza povrchově aktivních fosfolipidů vede ke vzniku cytotoxického lysofosfatidylcholinu, který může mít přímý detergentní účinek na membránu a ovlivnit aktivitu membránových kanálů a proteinů. Navíc se transformuje na faktor aktivující krevní destičky a způsobuje narušení permeability alveolární kapilární bariéry, bronchospasmus a agregaci krevních destiček.
Předpokládá se také, že cPLA2 se podílí na výskytu a rozvoji plicní fibrózy, což je v současnosti málo pochopená intersticiální léze plicního parenchymu. Patogeneze tohoto stavu zahrnuje nadměrnou produkci prozánětlivých mediátorů, alveolární zánět, proliferaci fibroblastů a akumulaci kolagenu. Klasickým experimentálním modelem pro tento stav je plicní fibróza indukovaná intratracheálním nebo intraperitoneálním podáním bleomycinu.
Role fosfolipázy v rozvoji některých forem pankreatitidy je velká.
Při insuficienci velké duodenální papily a zvýšeném tlaku v duodenu je možný reflux žluči nebo obsahu duodena do pankreatických vývodů. Žluč, která vstupuje do pankreatických kanálků, může být vystavena pankreatické fosfolipáze, již aktivované trypsinem, což vede k tvorbě lysolecitinu, který proniká do intersticiálního prostoru pankreatu a způsobuje hluboké poškození v buňkách.
Dr. Heidi May také dokázala, že PLA2 spojená s lipoproteinem předpovídá riziko koronární smrti.
Informace získané v posledních letech o účasti cytosolického a sekrečního PLA2 na vzniku plicní patologie otevírají perspektivu nových přístupů k léčbě takových onemocnění. Nejprve je však nutné jasně definovat místo těchto enzymů v patogenetickém řetězci molekulárních dějů. Zde může být důležitý „syndromický“ přístup. Například stále neexistují žádné informace o stavu PLA2 během hypertermie a hypoxie nebo během aktivace produkčních buněk. Mezitím je většina plicních onemocnění charakterizována těmito stavy, které do značné míry určují klinický obraz, průběh a výsledek patologického procesu.
2.7 Biologická role PLA2
K dnešnímu dni byl secernovaný PLA2 savčích jedů a pankreatických žláz dostatečně plně charakterizován a studován. Naproti tomu relativně nízké in vivo koncentrace intracelulárního a nepankreatického extracelulárního PLA2 vážně komplikují studie této třídy enzymů.
Bylo zjištěno, že membránově vázaný PLA2 hraje důležitou roli v regulačních procesech buněčného metabolismu. Je známo několik cest pro regulaci těchto enzymů, ale obecný mechanismus je velmi složitý a není zcela objasněn. PLA2 se podílí na přenosu chemických signálů přes membrány v reakci na vnější vlivy Enzym účinně hydrolyzuje fosfolipidy obsahující peroxidy mastných kyselin, čímž obnovuje strukturální a funkční vlastnosti buněčných membrán. Zjevně změna molekulární konformace oxidovaných lipidů usnadňuje přístup enzymu k sn-2-esterové vazbě.
Dnes bylo zjištěno, že fosfolipázy A2 hrají významnou roli v rozvoji zánětlivého procesu. Příspěvkem enzymu je spuštění syntézy lipidových regulátorů této reakce - jedné ze skupin tzv. chemických mediátorů zánětu. Tvoří se, aktivují nebo mobilizují v zánětlivém ložisku a jejich vztah určuje povahu patologického procesu. Mediátory lipidového zánětu jsou reprezentovány mastnými kyselinami a jejich deriváty (prostaglandiny, leukotrieny, tromboxany) a také fosfolipidovým faktorem aktivujícím destičky (PAF). Předpokládá se, že na zánětlivém procesu se podílí intracelulární cytosolová PLA2, která uvolňuje polyenové kyseliny z polohy sn-2 glycerolového zbytku membránových fosfolipidů Polyenové mastné kyseliny, včetně kyseliny arachidonové, mají vlastní biologickou aktivitu, vč. zvyšují vaskulární permeabilitu, způsobují agregaci krevních destiček a mají vazoaktivní účinek.
Dalšími produkty hydrolytické reakce fosfolipázy jsou lysofosfolipidy, které mají výraznou cytotoxicitu a detergentní vlastnosti. Tyto sloučeniny se vyskytují u nemocí, jako je cholecystitida, infarkt myokardu, šedý zákal, lupénka atd. Když se mastná kyselina uvolní z fosfatidylcholinu typu 1-O-alkyl, výsledný lysofosfolipid slouží jako prekurzor PAF, mediátor zánětu, alergických reakcí, septického šoku a astmatických stavů. Tato sloučenina je v současné době intenzivně studována; velké množství publikací bylo věnováno agonistům a antagonistům PAT.
Význam membránově vázaného PLA2 v buněčné regulaci, stejně jako jeho zvýšená hladina v řadě patologických procesů, vedou k potřebě regulovat aktivitu tohoto enzymu. Proto je v současné době v praktickém zájmu hledání nových tříd lipidových inhibitorů a vývoj vhodných metod pro jejich syntézu.

Bibliografie
1. Bragina N.A., Chupin V.V., Bulgakov V.G. Lipidové inhibitory fosfolipázy A2, M., 1999, str. 83-96
2. Brockerhoff X., Jensen R., Lipolytické enzymy, trans. z angličtiny, M., 1978, str. 242-356

Fosfolipáza- enzym, který hydrolyzuje fosfolipidy. Existují 4 hlavní třídy fosfolipáz: A, B, C a D, z nichž každá hydrolyzuje specifickou vazbu ve fosfolipidu. Fosfolipázy třídy A se dělí na fosfolipázy AI, které odštěpují SN-1 acylový řetězec fosfolipidu, a fosfolipázy A2, které odštěpují SN-2 acylový řetězec. Mezi fosfolipázy A2 patří:

• extracelulární fosfolipázy A2 hadích, plazích a hmyzích jedů
• pankreatická fosfolipáza
• intracelulární fosfolipázy A2

Pankreatická fosfolipáza

Pankreatická fosfolipáza- fosfolipáza třídy A2 (EC 3.1.1.4), lipolytický enzym, který rozkládá tuky v potravinách (triglyceridy). Je vylučován ve formě pankreatického proenzymu profosfolipázy, který je aktivován v tenkém střevě trypsinem (Sablin O.A. et al.). Optimální acidita pro katalytickou aktivitu pankreatické fosfolipázy je 7,5–9,0 pH. „Pracuje“ jako enzym v přítomnosti Ca 2+ (což je koenzym pro fosfolipázu).

Když je žlučový lecitin hydrolyticky štěpen fosfolipázou A, vzniká lysolecitin. Další metabolismus lysolecitinu je katalyzován fosfolipázou B, která je inhibována žlučovými kyselinami (Maev I.V. et al.)

Úloha fosfolipázy při rozvoji některých forem pankreatitidy

Při insuficienci velké duodenální papily a zvýšeném tlaku v duodenu je možný reflux žluči nebo obsahu duodena do pankreatických vývodů. Žluč vstupující do pankreatických vývodů může být vystavena pankreatické fosfolipáze, již aktivované trypsinem, což vede k tvorbě lysolecitinu, který proniká do intersticiálního prostoru pankreatu a způsobuje hluboké poškození buněk. Obsah tématu "Endokrinní systém. Chemická podstata a obecné mechanismy účinku hormonů.":
1. Endokrinní systém. Chemická podstata a obecné mechanismy účinku hormonů.
2. Mechanismy účinku peptidových, proteinových hormonů a katecholaminů. Ligand.
3. Základní systémy sekundárních zprostředkovatelů. Adenylátcyklázový systém - cAMP.

5. Systém kalcium-kalmodulin. Propojení sekundárních zprostředkovatelů.
6. Mechanismus účinku steroidních hormonů. Genomický mechanismus účinku.
7. Negenomický mechanismus účinku steroidních hormonů.
8. Samoregulace efektorové citlivosti na hormonální signály. Desenzibilizace (snížená citlivost) buňky.
9. Regulační funkce hormonů hypofýzy. Adenohypofýza. Neurohypofýza.
10. Prokrvení adenohypofýzy a neurohypofýzy.

Systém guanylátcykláza-cGMP.

K aktivaci membránové guanylátcyklázy nedochází pod přímým vlivem komplex hormonálních receptorů, ale nepřímo prostřednictvím ionizovaného vápníku a oxidačních membránových systémů. Ke stimulaci aktivity guanylátcyklázy, která určuje účinky acetylcholinu, dochází také nepřímo prostřednictvím Ca2+. Prostřednictvím aktivace guanylátcyklázy je realizován účinek atriálního natriuretického hormonu, atriopeptidu. Aktivací peroxidové oxidace stimuluje endoteliální hormon cévní stěny oxid dusnatý, relaxační endoteliální faktor, guanylátcyklázu. Pod vlivem guanylátcyklázy z GTP je syntetizován pomocí cGMP, aktivace cGMP-dependentních proteinkináz, které snižují rychlost fosforylace lehkých řetězců myosinu v hladkých svalech cévních stěn, což vede k jejich relaxaci. Ve většině tkání jsou biochemické a fyziologické účinky cAMP a cGMP opačné. Příklady zahrnují stimulaci srdečních kontrakcí pod vlivem cAMP a inhibici kontrakcí cGMP, stimulaci kontrakce střevních hladkých svalů pomocí cGMP a inhibici cAMP. cGMP zajišťuje hyperpolarizaci retinálních receptorů pod vlivem světelných fotonů. Enzymatická hydrolýza cGMP a následně zastavení hormonálního účinku se provádí pomocí specifické fosfodiesterázy.

Rýže. 6.2. Zprostředkování hormonálních signálů systémem fosfolipázy C-inositol-3-fosfátu.

Vznik komplexu hormon-receptor za účasti regulačního G proteinu aktivuje membránovou fosfolipázu C, která způsobí hydrolýzu membránových fosfolipidů za vzniku dvou sekundárních poslů: inositol-3-fosfátu a diacylglycerolu. Inositol-3-fosfát vede k uvolňování Ca2+ z intracelulárních zásob. Vazba ionizovaného vápníku na specializovaný protein kalmodulin aktivuje proteinkinázy a způsobuje fosforylaci intracelulárních strukturních proteinů a enzymů. Diacylglycerol zvyšuje afinitu proteinkinázy C k Ca2+, čímž podporuje její aktivaci, což také vede k fosforylaci proteinu. Diacylglycerol současně realizuje další způsob zprostředkování hormonálního účinku, aktivaci fosfolipázy A-2 a tvorbu prostanoidů.

Systém fosfolipázy C - inositol-3-fosfát.

Komplex hormonálních receptorů za účasti regulačního G proteinu vede k aktivaci membrány enzym fosfolipáza C způsobující hydrolýzu membránových fosfolipidů s tvorbou dvou sekundárních poslů: inositol 3-fosfát a diacylglycerol.Inositol 3-fosfát způsobuje uvolňování Ca2+ z intracelulárních zásob, hlavně z endoplazmatického retikula, ionizovaný vápník se váže na specializovaný protein kalmodulin, který zajišťuje aktivaci proteinkináz a fosforylaci intracelulárních strukturních proteinů a enzymů. Diacylglycerol zase podporuje prudké zvýšení afinity proteinkinázy C k ionizovanému vápníku, ten jej aktivuje bez účasti kalmodulinu, což také končí procesy fosforylace proteinů. Diacylglycerol současně realizuje další způsob zprostředkování hormonálního účinku aktivací fosfolipázy A-2. Vlivem posledně jmenovaného vzniká z membránových fosfolipidů kyselina arachidonová, která je zdrojem látek se silnými metabolickými a fyziologickými účinky - prostaglandinů a leukotrienů. V různých buňkách těla převládá jedna nebo druhá cesta pro tvorbu sekundárních poslů, což nakonec určuje fyziologický účinek hormonu. Prostřednictvím uvažovaného systému druhých poslů jsou realizovány účinky adrenalinu (ve spojení s alfa-adrenoreceptorem), vasopresinu (ve spojení s receptorem V-1), angiotensinu-I, somatostatinu a oxytocinu.

Strana 1

Fosfolipáza A2 (E.F.3.1.1.4.) je enzym, který katalyzuje odštěpování zbytků mastných kyselin – lecitinu, kefalinu – z fosfolipidů a přeměňuje je na toxické sloučeniny, které výrazně snižují povrchové napětí. Tyto sloučeniny rozpouštějí červené krvinky a další buněčné a subcelulární struktury, a proto se nazývají lysolecitiny a lysokefaliny.

V molekule fosfolipidu fosfolipáza z včelího jedu odštěpuje mastnou kyselinu z druhého místa v molekule, a proto se nazývá fosfolipáza A2. Od roku 1897 je znám (Langer) jako faktor, který zvyšuje hemolytickou aktivitu včelího jedu po přidání lecitinu. Fosfolipáza je nejvíce studovaným enzymem ve včelím jedu. Fosfolipáza byla objevena jako trávicí enzym v roce 1900. Nyní je jasné, že fosfolipáza A2 (PLA2) je více než trávicí enzym. Je rozšířený a přítomný ve většině savčích buněk a tkání, slouží jako regulátor metabolismu, udržuje membránovou homeostázu a tvoří prekurzory eikosanoidů.

Podle molekulové hmotnosti, buněčné lokalizace a přítomnosti Ca2+ iontů se rozlišuje cytosolická PLA2, sekreční a na Ca-nezávislá PLA2 nebo vnější membránová PLA2.

PLA2 obsahují několik nepříbuzných proteinových rodin se společnými enzymatickými aktivitami. Dvě nejdůležitější rodiny jsou secernované a cytosolové fosfolipázy A2.

Cytosolická PLA2:

Intracelulární fosfolipázy, stejně jako extracelulární, jsou enzymy závislé na vápníku. Strukturálně se však velmi liší od sekretovaných fosfolipáz. Obvykle jsou mnohem větší (více než 700 aminokyselin) a obsahují doménu C2, která směruje enzym do buněčné membrány. Tyto fosfolipázy se účastní především buněčných signálních drah, jako je zánětlivá odpověď. Vlivem PLA2 se v buňce může tvořit kyselina arachidonová, prekurzor eikosanoidů, aktivních signálních molekul, jako jsou leukotrieny a prostaglandiny.

Vnější membrána PLA2:

Gramnegativní bakterie obsahují na své vnější membráně PLA2 s širokým rozsahem specificity. U Escherichia coli se tento enzym podílí na uvolňování bakteriocinového toxinu z buňky v důsledku zvýšené permeability membrány se zvýšením hladiny lysofosfolipidů a mastných kyselin v membráně.

Skrytá PLA2:

Extracelulární formy fosfolipáz byly izolovány z různých jedů hadů, včel a vos. Nacházejí se také ve všech tkáních savců a v bakteriích. Aktivita těchto fosfolipáz vyžaduje přítomnost vápníku.

Fosfolipáza A2 z včelího jedu v extracelulárním prostoru poblíž lipidové dvojvrstvy. Polární skupiny fosfolipidů se nacházejí mezi žlutou a červenou rovinou. Nepolární acylové řetězce jsou mezi červenou a černou rovinou.

Pankreatická fosfolipáza je trávicí enzym a podílí se na trávení potravinových lipidů. Fosfolipázy z jedu se podílejí na imobilizaci oběti v důsledku lýzy jejích buněk.

Historie cytosolových fosfolipáz skupiny A2 začala v roce 1991, kdy byl z cytosolu různých živočišných buněk izolován a klonován protein o molekulové hmotnosti 85 kDa, který se kromě molekulové hmotnosti lišil od tehdy známých fosfolipáz. čas v nepřítomnosti disulfidových můstků a citlivosti na vápník. Později screening nukleotidových bází umožnil najít další dva paralogy – cPLA2b a cPLA2g. První nalezený protein byl pojmenován cPLA2a. Tento enzym, nazývaný „cytosolický“, přesto působí na membrány cytoplazmatického retikula a jádra. Tato izoforma PLA2 je přítomna v mnoha buňkách a tkáních: mozek, ledviny, slezina, plíce, makrofágy, neutrofily, alveolární epiteliální buňky atd. Enzym se stává aktivním v důsledku fosforylace mitogenem aktivovanými proteinkinázami a proteinkinázou C. Aktivaci a syntézu cytosolické PLA2 indukují různé extracelulární cytokiny, mitogeny, hormony, neurotransmitery, růstové faktory, antigeny, endotoxiny a také určité fyzické a stresové vlivy, včetně ultrafialového světla a oxidačního stresu.

Úvod

1. Fosfolipázy

1.1 Klasifikace. Vlastnosti

2. Fosfolipáza A2

2.1 Obecné informace (reakce, objev, struktura)

2.2 Klasifikace a vlastnosti

2.2.1 Cytosolický PLA2

2.2.2 Sekreční PLA2

2.2.3 Na vápníku nezávislý PLA2

2.3 Specifičnost substrátu

2.4 Inhibitory PLA2

2.4.1 Nekompetitivní inhibice

2.4.2 Konkurenční inhibice

2.5 Důsledky pro tělo v případě poruchy aktivity

2.6 Využití PLA2 v medicíně

2.7 Biologická role PLA2

Bibliografie

Úvod

Fosfolipázy jsou enzymy třídy hydroláz, které katalyzují hydrolýzu fosfoglyceridů V závislosti na poloze hydrolyzované vazby ve fosfolipidu existují 4 hlavní třídy fosfolipáz: A, B, C a D.

Lysofosfolipidy jsou štěpeny fosfolipázami L (existence polohově specifických fosfolipáz L1 a L2 nebyla prokázána). Fosfolipáza B je zastaralý název. léky s aktivitou typu fosfolipázy A a L.

X - zbytek cholinu, serinu, myoinositolu atd.; pro fosfolipázy L1 R2=C(0)R4, R3=H; pro fosfolipázy L2 R2=H, R3=C(O)R4

Každá z rodin fosfolipáz je heterogenní a zahrnuje enzymy, které se významně liší molekulovou hmotností, složením podjednotek a dalšími vlastnostmi. Všechny fosfolipázy nejaktivněji katalyzují hydrolýzu na rozhraní fosfolipid-voda; pomalu hydrolyzovat ve vodě rozpustné substráty.

Fosfolipáza A1- (EC 3.1.1.32, anglická fosfolipáza A1) odštěpuje SN-1 acylový řetězec.

Fosfolipáza A2- (EC 3.1.1.4, anglická fosfolipáza A2) odštěpuje SN-2 acylový řetězec.

Fosfolipáza B-(lysofosfolipáza, anglicky phospholipase B) odštěpuje oba SN-1 a SN-2 acylové řetězce. Fosfolipáza, která má aktivity jak fosfolipázy A1, tak A2, to znamená, že je schopná hydrolyzovat acylový řetězec fosfolipidu v polohách sn-1 a sn-2.

Fosfolipáza C- (EC 3.1.4.3, anglicky phospholipase C) hydrolyzuje vazbu mezi glycerolovým zbytkem fosfolipidu a polární fosfátovou skupinou, což vede ke vzniku diacylglycerolu a polární skupiny obsahující fosfát.

Fosfolipáza D- (EC 3.1.4.4, anglicky phospholipase D) hydrolyzuje vazbu mezi fosfátovou skupinou a alkoholovou skupinou, uvolňuje kyselinu fosfatidovou a alkohol. Existují 2 izoformy této fosfolipázy D1 a D2.

Fosfolipázy hrají důležitou roli v metabolismu lipidů v živých organismech. Používají se ke stanovení struktury fosfoglyceridů a jejich umístění v membránách.

1. Fosfolipázy.

1.1 Klasifikace. Vlastnosti

Ve skutečnosti se rozlišuje několik fosfolipáz skupiny A, které jsou nedílnou součástí mnoha tkání a sekretů živých organismů.

Fosfolipáza A1 Intracelulární enzymy, často vázané na membránu, většinou nevyžadují koenzym. Jejich molekulové hmotnosti se pohybují mezi 15-90 tisíci; optimální katalytická aktivita nastává při pH 4,0 (pro lysozomální enzymy) nebo 8,0-9,5 (pro enzymy mikrosomů, plazmatických membrán a cytosolu); široce distribuován v živočišných tkáních (játra, srdce, mozek) a v mikroorganismech (Bacillus subtilis, B. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli).

Fosfolipázy A1 odštěpují fosfolipidový acylový řetězec v poloze sn-1. Působením fosfolipázy AI na fosfolipid vzniká 1-lysofosfolipid a mastná kyselina. Fosfolipáza je aktivní složkou hadího jedu s hemolytickým účinkem.

Fosfolipáza A2- nejstudovanější zástupci fosfolipáz. Jsou známy 3 skupiny A2 fosfolipáz: 1) enzymy z jedů hadů, plazů a hmyzu, existující ve formě velkého množství izoforem; 2) enzymy slinivky břišní, produkované v těle ve formě zymogenů (prekurzory s vyšší molekulovou hmotností) a aktivované trypsinem; 3) intracelulární enzymy z krve a tkání zvířat, mezi nimiž jsou jak rozpustné, tak membránově vázané.

Fosfolipázy A2 prvních dvou podskupin jsou ve vodě rozpustné enzymy s molekulovou hmotností 11-19 tisíc (některé jsou aktivní ve formě dimerů) a jsou vysoce stabilní díky velkému počtu (6-7) disulfidových vazeb. Optimální katalytická aktivita při pH 7,5-9,0; pl od 4,0 do 10,5; koenzym - Ca2+. U mnoha zástupců těchto podskupin fosfolipáz jsou známy primární a prostorové struktury. V aktivním centru byly nalezeny zbytky histidinu a kyseliny asparagové. Vlastnosti intracelulárních fosfolipáz A2 (třetí podskupina) závisí na subcelulární lokalizaci enzymu. Jejich molekulová hmotnost je 12-75 tisíc; optimální katalytická aktivita při pH 4,2-9,0. Některé enzymy této podskupiny neobsahují koenzymy.

Fosfolipáza B izolované z rostlin, mikroorganismů, včelího jedu a savčích tkání. Enzymy této skupiny jsou extrémně nespecifické, katalyzují hydrolýzu různých esterových vazeb a mají lytický (destruktivní) účinek na biologické membrány (což určuje jejich toxicitu). Molekulová hmotnost fosfolipáz B je 15-65 tisíc, jsou méně stabilní než fosfolipázy A; jejich optimální katalytická aktivita nastává při pH 4,5 (lyzozomální enzym) až 10,0 (jedovaté enzymy). Fosfolipázy nemají koenzymy a nejsou inhibovány kyselinou ethylendiamintetraoctovou. Některé fosfolipázy B jsou inhibovány diisopropylfluorfosfátem a kyselinou p-chlormercurbenzoovou. Univerzální inhibitory všech fosfolipáz B - surfaktanty.

Fosfolipáza B je schopna hydrolyzovat acylový řetězec fosfolipidu v polohách sn-1 a sn-2 Fosfolipáza zpravidla působí na lysolecitin (lysofosfatidylcholin), který vzniká působením fosfolipázy A1 na lecitin (. fosfatidylcholin).

Fosfolipáza C nachází se v bakteriích Clostridium, Bacillus a Pseudomonas a také v buňkách savců (játra, mozek, slinivka břišní). Některé z nich se vyznačují přísnou specifitou s ohledem na alkoholovou skupinu molekuly substrátu, například na cholinový zbytek (fosfolipáza Cx) a myoinositol (fosfolipáza C). Molekulová hmotnost fosfolipáz C je od 23 do 51 tis. ionty Zn2+ jsou pro ně koenzymem a stabilizátorem. Optimální katalytická aktivita při pH kolem 7 pro fosfolipázy Cx a při pH< 7 для фосфолипаз Си.

Fosfolipáza C, která hydrolyzuje fosfodiesterovou vazbu mezi glycerolovým zbytkem fosfolipidu a polární fosfátovou skupinou, patří mezi fosfodiesterázy stejně jako fosfolipáza D. Fosfolipáza C je klíčovým enzymem v metabolismu fosfatidylinositolu a lipidových signálních drah.

Fosfolipáza C je aktivována podjednotkami Gαq nebo Gβγ G proteinu. Je tedy součástí receptoru spřaženého s G proteinem a odpovídající signální dráhy nebo součástí transmembránového receptoru s vlastní nebo přidruženou tyrosinkinázovou aktivitou.

Fosfolipáza C hydrolyzuje fosfatidylinositol (PIP2) na dva sekundární mediátory inositoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). Tyto mediátory se zapojují do následných fází signálních drah. Zejména modulují vápníkové kanály endoplazmatického retikula a proteinkinázu C, v daném pořadí.

Fosfolipáza D patří do skupiny důležitých enzymů, které v živých systémech plní různé funkce od vstřebávání živin až po syntézu biologicky aktivních látek. Nachází se v rostlinách (zelenina, řasy), mikroorganismech a živočišných tkáních. Jejich molekulová hmotnost je 90-116 tis. Optimální katalytická aktivita při pH 4,7-8,0. Kationtové povrchově aktivní látky inhibují fosfolipázy D, zatímco aniontové povrchově aktivní látky je aktivují.

Fosfolipáza D vykazuje primárně hydrolytickou aktivitu, která vede ke štěpení esterové vazby mezi zbytky kyseliny fosfatidové a alkoholem v molekulách fosfolipidu (PL). V tomto případě je druhý nahrazen vodíkem, ale zbytek kyseliny fosfatidové lze přenést na různé akceptory obsahující hydroxylové skupiny, což je velmi zajímavé pro biotechnologii, protože transfosfatidylační aktivita fosfolipázy může být využita pro syntézu různých drogy.

Fosfolipáza D specificky štěpí fosfatidylcholin na kyselinu fosfatidovou a cholin, přičemž cholin uvolňuje do cytoplazmy.

fosfatidylcholin kyselina fosfatidová cholin

1.2 Fosfolipáza C - inositol-3-fosfátový systém

K aktivaci membránové guanylátcyklázy nedochází pod přímým vlivem komplexu hormon-receptor, ale nepřímo prostřednictvím ionizovaného vápníkového a oxidačního membránového systému. Ke stimulaci aktivity guanylátcyklázy, která určuje účinky acetylcholinu, dochází také nepřímo prostřednictvím Ca2+. Prostřednictvím aktivace guanylátcyklázy je realizován účinek atriálního natriuretického hormonu, atriopeptidu. Aktivací peroxidové oxidace stimuluje endoteliální hormon cévní stěny oxid dusnatý, relaxační endoteliální faktor, guanylátcyklázu. Pod vlivem guanylátcyklázy je z GTP syntetizován cGMP, který aktivuje cGMP-dependentní proteinkinázy, které snižují rychlost fosforylace lehkých řetězců myosinu v hladkých svalech cévních stěn, což vede k jejich relaxaci.

Ve většině tkání jsou biochemické a fyziologické účinky cAMP a cGMP opačné. Příklady zahrnují stimulaci srdečních kontrakcí pod vlivem cAMP a inhibici kontrakcí cGMP, stimulaci kontrakce střevních hladkých svalů pomocí cGMP a inhibici cAMP. cGMP zajišťuje hyperpolarizaci retinálních receptorů pod vlivem světelných fotonů. Enzymatická hydrolýza cGMP a následně zastavení hormonálního účinku se provádí pomocí specifické fosfodiesterázy.